IV. Ph ạm vi nghiên cứu
2.2.4.Nội dung 4: Khảo sát ảnh hưởng của các phương pháp xử lí ra hoa đến hoạt
hoạt tính của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong đỉnh sinh trưởng của
nhãn Xuồng cơm vàng
Mẫu phân tích gồm chồi dinh dưỡng trước khi xử lí hóa chất và chồi dinh dưỡng sau khi xử lí hóa chất ở các nghiệm thức khác nhau của nhãn Xuồng cơm vàng.
• Li trích và phân đoạn
Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong chồi ngọn nhãn Xuồng cơm vàng được li trích và phân đoạn trong phòng tối với ánh sáng đỏ, có quạt hút thông khí theo Bùi Trang Việt (1992), Lê Thị Trung (2003), Bùi Thị Mỹ Hồng (2009), Nguyễn Du Sanh (2013)…
Nghiền 05 g vật liệu tươi trong 10 ml metanol 80% đậy giấy bạc để trong tối 24 giờ, thỉnh thoảng lắc. Lọc thu dịch lọc I. Thêm vào bã 20 ml metanol 80%, lắc 20 phút. Lọc thu lấy dịch lọc II. Lặp lại một lần nữa thu dịch lọc III. Hòa chung dịch lọc I, II, III cô cạn dịch lọc này còn 1 ml [10], [12], [17].
Sơ đồ 2.1. Li trích và phân đoạn chất điều hòa tăng trưởng thực vật.
• Sắc ký lớp mỏng
Dịch acid và trung tính (trong eter) của chồi được chấm trên bản sắc kí lớp mỏng bằng nhôm tráng silica gel F254(Merck) kích thước 20 x 20 cm .
Sử dụng micropipet chấm eter cô cạn và chất chuẩn cách mép 2 cm. Sau mỗi lần chấm, dùng máy sấy làm khô vị trí này và sau đó tiếp tục chấm cho đến khi hết dịch eter. Chấm các điểm tương tự với hỗn hợp chất chuẩn (khoảng 5µl) gồm IAA, ABA và GA3 tinh khiết nồng độ 200 mg/l cho mỗi chất.
Đặt bản silicagel vào thùng sắc kí dùng dung môi di chuyển. Dung môi di chuyển gồm Isopropanol: Amon hydroxyd: H2O =10: 1: 1 (v/v). Nhiệt độ 30-32o
C. Theo mao dẫn dung môi sẽ di chuyển dọc trên bản mỏng sắc kí và tùy thuộc vào đặc tính hòa tan của các chất mà chúng sẽ được phân ly tại các vị trí khác nhau trên bản sắc kí. Khi mức dung môi cách mép 1 cm thì sắc kí kết thúc. Lấy bản sắc kí ra khỏi thùng, dùng bút chì đánh dấu mực dung môi và làm khô bản sắc kí [14], [17], [19].
• Phát hiện và cô lập
Sử dụng đèn UV chiếu trên bản mỏng silicagel để phát hiện và xác định vị trí của IAA, Zeatin, GA3 và ABA trên bảng sắc kí. Các vị trí này tùy thuộc vào hệ dung môi di chuyển và nhiệt độ môi trường khai triển sắc kí. Trong hệ dung môi trên GA3 (Rf = 0,72 – 0,76), IAA (Rf = 0,57 – 0,71), ABA (Rf = 0,78 – 0,85), Zeatin (Rf = 0,92 – 0,96). Các chất chuẩn, hỗn hợp các chất nội sinh sẽ được phát hiện và cô lập riêng bằng cách dùng dao lam cạo lấy các hạt silic từng vùng trên bảng sắc kí vào các ống nghiệm nhỏ để chuẩn bị giải hấp trước khi sinh trắc nghiệm [14], [17], [19].
• Sự giải hấp
Giúp cho các chất điều hòa tăng trưởng thực vật sau khi được cô lập vào các hạt silic trên bảng sắc kí có thể tách rời và hòa tan tốt trong dung môi.
Thêm 3 ml dung môi giải hấp vào ống nghiệm và vortex 3 phút. Li tâm 1.500v/p (3 phút).
Dịch nổi sau hai lần giải hấp của mỗi chất được cho vào đĩa petri hoặc erlen 100ml và cô cạn, sau đó thêm 10ml nước cất và dùng đũa thủy tinh khuấy đều để hòa tan hoàn toàn các chất vào dung dich để chuẩn bị sinh trắc nghiệm [19].
• Định lượng chất điều hòa tăng trưởng bằng sinh trắc nghiệm
Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật dựa trên các sinh trắc nghiệm [14], [17], [19], [23].
- Hoạt tính IAA và ABA được đo bằng sinh trắc nghiệm khúc cắt diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.). Diệp tiêu lúa sau khi gieo khoảng ba ngày (khi bao diệp tiêu chưa bị xé), diệp tiêu cao 15 mm. Cắt diệp tiêu (trong phòng tối+ ánh sáng đỏ): cắt bỏ một đoạn 05 mm ngọn diệp tiêu, cắt bỏ gốc diệp tiêu về phía hột và rút lá mầm ra khỏi diệp tiêu. Dùng dao cắt chuyên biệt để tạo khúc cắt diệp tiêu dài bằng nhau (02 mm). Các khúc cắt được cho vào hộp petri chứa nước cất. Sau đó dùng kẹp gắp ngẫu nhiên 10 khúc cắt diệp tiêu cho vào mỗi hộp petri chứa dung dịch trích và dung dịch chuẩn, trong tối. Sau 24 giờ, đo sự sai lệch chiều dài khúc cắt diệp tiêu so với chuẩn sẽ xác định được hoạt tính tương đương IAA hay ABA.
- Hoạt tính GA3 được đo dựa trên sự sai biệt về chiều cao trụ hạ diệp cây mầm xà lách (Lactuca sativa L.). Hạt xà lách sau khi ngâm 24 giờ khi rễ mầm vừa ra khỏi vỏ,
gắp ngẫu nhiên 10 hột vào mỗi erlen chứa dung dịch trích và dung dịch chuẩn, đậy erlen bằng giấy parafirm và đặt trong phòng tăng trưởng có ánh sáng liên tục cường độ 3000 lux nhiệt độ 28 ± 2oC.
- Sau 72 giờ xác định chiều cao trụ hạ diệp cây mầm xà lách bằng thước mm (tính từ gốc thân đến vị trí tử diệp). Sự sai biệt về chiều cao trụ hạ diệp trong mỗi dung dịch so với chuẩn và các chất tinh khiết sẽ cho biết hoạt tính tương đương của GA3 nội sinh.
- Hoạt tính zeatin được đo dựa trên sự sai biệt trọng lượng tử diệp dưa leo (Cucumis sativus L.). Hạt dưa chuột ngâm nước trong tối (24 giờ) tới khi rễ mầm vừa chui ra khỏi vỏ 5 mm, lột bỏ vỏ cứng và phần bao hai tử diệp. Cắt rời hai tử diệp với rễ mầm, cho phần tử diệp vào nước cất.
- Cân 5 mảnh tử diệp bằng cân phân tích. Đặt theo thứ tự tử diệp lên lam (mặt trong tử diệp úp xuống), đặt vào mỗi hộp petri chứa dung dịch trích và dung dịch chuẩn. Đặt hộp petri trong phòng tăng trưởng có ánh sáng liên tục cường độ 3000 lux nhiệt độ 28 ± 2o
C (48giờ).
- Cân lại tử diệp theo thứ tự để xác định sự sai biệt trọng lượng trước và sau khi thí nghiệm. Sự sai biệt trọng lượng này từ các mẫu sẽ cho biết hoạt tính tương đương của zeatin nội sinh.