IV. Ph ạm vi nghiên cứu
2.2.3. Nội dung 3: Quan sát hình thái giải phẫu của chồi non
Quan sát, so sánh sự biến đổi hình thái của chồi vào hai giai đoạn dinh dưỡng và sinh trưởng của hoa nhãn qua lát cắt dọc [19].
Cắt dọc và nhuộm mẫu theo các bước sau:
- Cố định mẫu: Chồi sau khi hái được giữ trong môi trường FAA. Sau 24 giờ, chuyển mẫu vào etanol 700
.
- Đúc mẫu: Mẫu được loại nước bằng cách đặt lần lượt trong etanol 700, 950 , 1000 (03 lần lặp lại cho mỗi loại etanol, mỗi lần 15 phút). Sau đó, chuyển mẫu lần lượt qua các lọ butanol trong 30 phút, 30 phút, 60 phút, qua đêm để loại nước một cách triệt để. Tiếp tục đặt mẫu trong parafin tan ở 56 - 600C (hãng Merck) (3 lần lặp lại, mỗi lần 1 giờ). Cuối cùng, đúc mẫu trong khuôn.
- Cắt và dán mẫu: Mẫu được cắt dọc thành lát mỏng 7 µm nhờ máy vo phẫu (microtome). Băng parafin có chứa mẫu được cắt thành từng đoạn ngắn và dán lên lam chứa dung dich gelatin loãng. Đặt mẫu trên bếp ở nhiệt độ khoảng 300
C. Mẫu dãn ra dán chặt vào lam. Giữ mẫu trong tủ ấm ở 300C trong 2 ngày đễ mẫu thật khô.
- Nhuộm mẫu: Mẫu được loại parafin bằng cách đặt trong methyicyclohexan trong 5 phút. Hai lần lặp lại. Rửa mẫu bằng etanol 1000
rồi đặt lại trong 1000
trong 05 phút. Chuyển mẫu lần lượt qua etanol 950, 700, nước cất. Mỗi giai đoạn thực hiện trong 5 phút. Sau đó, mẫu được nhuộm bằng xanh methyl aluné trong 20 phút, đỏ ruthénium trong 30 phút.
- Giữ mẫu: Sau khi nhuộm mẫu được loại nước ngay bằng cách đặt mẫu trong etanol 700, 950, 1000 (2 lần), methylcylohexan (3 lần), mỗi giai đoạn được thực hiện 5 phút. Cuối cùng mẫu được dán lại bằng DPX (Fluka), sấy khô ở 370C ít nhất trong 4 ngày. Quan sát dưới kính hiển vi quang học.