Mỗi răng trong nghiên cứu được làm xét nghiệm vi khuẩn ba lần. Lần 1, trước tạo hình ống tủy (S1).
Lần 2, sau tạo hình và bơm rửa ống tủy bằng NaOCl 2,5% (S2).
Lần 3, sau đặt thuốc Ca(OH)2 hoặc CPC 7 ngày (S3).
Các mẫu xét nghiệm được đánh số thứ tự S1, S2, S3 tương ứng với lần 1, lần 2, lần 3 và có ký hiệu cho mỗi răng, mỗi bệnh nhân.
Tổng số mẫu nghiên cứu là 246, trong đó, nhóm sát khuẩn bằng calcium hydroxide là 123 mẫu và nhóm sát khuẩn bằng CPC là 123 mẫu.
Nghiên cứu vi khuẩn học sử dụng phương pháp nuôi cấy kỵ khí. Các vi khuẩn mọc sẽ được đếm số lượng.
Trong số 82 răng nghiên cứu, chúng tôi chọn 27 răng để xác định loài vi khuẩn. Chúng tôi lập danh sách các răng thứ tự từ 1 đến 82 cho tất cả các bệnh nhân theo thời gian đến khám. Tính khoảng cách lấy mẫu bằng cách lấy 82/27 = 3. Từ danh sách đó, chọn ngẫu nhiên răng đầu tiên. Răng thứ hai được chọn là số thứ tự răng đầu tiên + 3. Tương tự như vậy, chọn các răng khác đến khi đủ 27 răng. Chúng tôi chọn được trong 82 răng nghiên cứu có 13 răng ở nhóm sát khuẩn bằng calcium hydroxide và 14 răng ở nhóm sát khuẩn bằng CPC. Tất cả các răng đều được lấy mẫu xét nghiệm và tiến hành nuôi cấy kỵ khí. Những mẫu có vi khuẩn mọc, các khuẩn lạc được sử dụng để tách chiết DNA, chạy PCR và giải trình tự gen. Giải trình tự gen tìm 9 loài vi khuẩn hay gặp trong bệnh lý tủy răng hoại tử đã được nhiều nghiên cứu khẳng định [40], [80],…Các kỹ thuật được thực hiện tại Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương.
2.3.3.1. Phương tiện và vật liệu dùng cho nghiên cứu vi khuẩn học
* Vật liệu dùng trong thu thập bệnh phẩm
Sử dụng các eppenfort 1,8 ml, chứa 0,5 ml nước cất vô khuẩn
* Thiết bị, dụng cụ, hóa chất dùng cho nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí.
- Hệ thống máy VAC của hãng Don Whitley Scientific Limiteted – Anh. - Bình khí Carbon dioxide, air, hydro, nitrogen, hoặc bình khí trộn (10%
H2, 10% CO2, 80% N2), áp suất điều chỉnh 2- 4 bar.
- Chất xúc tác anotox, catalyst. - Pipet, que cấy nhựa.
- BA kỵ khí (BAYK) và BAYK có phenyl Ethyl Alcohol (BAYK-PEA) hay BAYK có nalidixic acid (BANa).
- Bộ thuốc nhuộm Gram.
- Giá đường API 20A (của hãng Biomerieux – Pháp).
* Hóa chất, sinh phẩm cho tách DNA
- Dung dịch isopropanol 75%, trong các chai loại 200 ml có nắp đậy. - Dung dịch NaCl 0,9%.
- Nước cất cho PCR, dung dịch TE - Dung dịch X1 PBS
- Bộ kít và các dung dịch kèm theo - Pipet các loại
- Đầu típ 1000 ul, 200 ul, 10 ul
- Các cốc thủy tinh loại 500 ml để bỏ dung dịch thừa (có nắp đậy) - Nồi cách thủy điều chỉnh 65 độ C, tủ ấm 37 độ C
- Các giá để tube
- Khay đá để sẵn trong tủ lạnh, khi dùng đập vụn đá vào hộp xốp. - Găng tay, bông cồn, giẻ lau,...
* Hóa chất sinh phẩm dùng cho chạy PCR
- Primer đặc hiệu cho gen 16S, RNA có mặt ở tất cả các vi khuẩn
- Dung dịch đệm (Perkin- Elmer, Mỹ)
- AmpliTaq Gold DNA polymerase (Perkin- Elmer)
- Hỗn hợp dNTPs gồm: dATP, dCTP, dGTP, dTTP (Perkin- Elmer)
- MgCl2 (Perkin- Elmer)
- 1 Kb DNA Ladder (Gibco-BRL)
- Thạch agarose dùng trong điện di (Gibco Life Technologies, Paisley, Anh)
- TAE (Tris Acetate EDTA) (Gibco-BRL). - Ethidium bromide.
* Dụng cụ, máy móc
- Máy điều nhiệt tự động GenAmp PCR System 9700 AB (Applied Biosystems, Mỹ).
- Máy ly tâm lạnh.
- Máy chụp ảnh gen và phim ảnh Kodak.
Hình 2.8. Máy điều nhiệt GenAmp PCR System
9700 AB (Mỹ)
Hình 2.9. Máy giải trình tự gen (Applied Biosystems, Mỹ)
2.3.3.2. Kỹ thuật nuôi cấy kỵ khí
- Chuẩn bị các chất xúc tác anotox, catalyst đặt vào trong máy VAC. - Cấy mẫu bệnh phẩm: Dùng pipet hút 50µl môi trường bảo quản bấc bệnh phẩm nhỏ lên bề mặt môi trường thạch máu BA kỵ khí (toàn bộ quy trình được thực hiện trong tủ nuôi cấy kỵ khí). Sau đó chuyển bình có đĩa BA
kỵ khí đã được cấy mẫu bệnh phẩm vào tủ ấm 370C trong 48 giờ.
- Sau 48 giờ, mở bình kỵ khí lấy đĩa BA kỵ khí đã nuôi cấy và chuyển vào tủ kỵ khí.
- Sau khi có vi khuẩn mọc, đánh giá tính chất khuẩn lạc về hình thể, màu sắc, tan máu,…
- Đếm số lượng từng loại khuẩn lạc để tính ra số lượng khuẩn lạc trong 1 đơn vị thể tích môi trường bảo quản bệnh phẩm. Số lượng này tương đương với số lượng vi khuẩn trong côn giấy thấm dịch ở ống tủy răng.
- Chọn một khuẩn lạc đại diện cho từng loại (trên môi trường BA kỵ khí vừa nuôi cấy) và cấy chuyển sang môi trường BA kỵ khí khác. Sau đó nhuộm Gram để quan sát hình dạng vi khuẩn qua kính hiển vi. Chụp ảnh hình thể vi khuẩn.
- Tiến hành tăng sinh từng loại khuẩn lạc,
- Tiến hành quy trình định danh vi khuẩn với API 20A được thực hiện trong tủ và ủ kỵ khí từ 24 giờ đến 36 giờ.
2.3.3.3. Định danh vi khuẩn bằng PCR và giải trình tự gen
* Kỹ thuật tách chiết DNA của vi khuẩn
DNA của vi khuẩn được tách chiết từ bấc bệnh phẩm bằng bộ kít
MasterPureTM DNA Purification Kit (Mỹ). Qui trình gồm các bước sau:
- Dùng đũa thủy tinh và bi thủy tinh vô khuẩn cho vào eppenford chứa bấc bệnh phẩm, nghiền nát bấc bệnh phẩm trong 15 phút, Sử dụng máy lắc, lắc đều trong 5 phút.
- Ly tâm 2000 vòng/ phút trong 5 phút, lấy nước nổi (bệnh phẩm). - Chuyển 50 ul bệnh phẩm sang một eppenford sạch, loại 1,5 ml
- Pha dung dịch Proteinase K (cho mỗi mẻ 10 bệnh phẩm) như sau: 10 ul dung dịch 50ug/ul Proteinase K cho vào 4000 ul (1 ul dung dịch 50ug/ul Proteinase K cho 400 ul dung dịch ly giải Tissue and Cell lysis Solution) (có trong bộ kít). Lắc đều trên máy lắc, ly tâm nhanh cho dung dịch xuống đáy.
- Cứ mỗi 50 ul bệnh phẩm cho 400 ul dung dịch Proteinase K. Lắc đều 1 phút trên máy lắc.
- Ủ ở 650C trong 25 phút, cứ sau 5 phút lại lắc đều một lần.
- Để hỗn hợp hạ nhiệt độ xuống 370C, thêm 1 ul dung dịch 5ug/ul Rnase
A vào mẫu, vortex đều trên máy.
- Lấy tube ra cho vào đá vụn hoặc cho vào ngăn đá trong tủ lạnh, để trong 10 phút.
- Thêm 250 ul dung dịch tủa Protein MPC (MPC Protein Precipitation Reagent) vào 450 ul dung dịch bệnh phẩm ở trên. Lắc đều trên máy lắc 10 giây.
- Ly tâm tube ở 12000 vòng/phút trong 10 phút.
- Chuyển cẩn thận phần nước nổi sang một 1,5 ml eppenford sạch khác, bỏ phần cặn.
- Thêm 600 ul isopropanol, lắc đều xuôi ngược 40 lần.
- Ly tâm tube ở 12000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ 40C.
- Hút bỏ nhẹ nhàng phần nước nổi, tránh làm bong phần ADN tủa màu trắng. - Cho 500 ul Ethanol 75%, lắc đều trên máy lắc 1 phút, ly tâm tube ở
12000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ 40oC. Hút bỏ nhẹ nhàng phần nước nổi.
- Nhắc lại bước trên thêm một lần. Hút bỏ hoàn toàn phần nước nổi và hạt nước dính ở thành tube.
- Để nghiêng tube, mở nắp cho bay hơi ethanol, làm khô tủa DNA trong 30 phút.
- Cho 20 ul dung dịch TE, dùng pipette và tip 200 ul trộn đều cho tan hết DNA. Dung dịch này làm template cho PCR.
Toàn bộ qui trình khoảng 3- 4 giờ.
* Kỹ thuật giải trình tự gen
- PCR khuếch đại gen: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen 16S RNA, tiến hành phản ứng khuếch đại gen này.
- Tinh sạch sản phẩm: Sử dụng bộ tinh sạch sản phẩm PCR của hãng Zymo (DNA Clean & Concentrator-5, Cat. No. D4003).
Cho 200µl Binding Buffer vào 20µl sản phẩm PCR, trộn đều bằng pipet. Chuyển hỗn hợp dịch lên cột tách.
Ly tâm 10.000xg/1 phút. Cho 200µl Wash Buffer lên cột, ly tâm 10.000xg/30 giây.
Lặp lại bước rửa này 1 lần nữa.
Chuyển cột tách sang ống eppenforf 2ml mới, sạch.
Cho 20µl nước vào cột tách, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, ly tâm 10.000xg/2 phút. Ta thu được sản phẩm PCR đã được tinh sạch.
- Quy trình giải trình tự gen (SEQUENCING REACTION - BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Kit - Applied Biosystems, CA, Mỹ).
Hỗn hợp phản ứng: Sample template 5µl Seq. Primer (5 pmol/µl) 1µl BigDye ver 3.0 Mix 4µl PCR (35 chu kỳ): 950C 15 giây
500C 15 giây
600C 4 phút Kéo dài 600C 5 phút
- Xử lý mẫu để cho vào máy giải trình tự, sử dụng bộ tinh sạch sản phẩm để giải trình tự gen của hãng Zymo (ZR DNA Sequencing Clean up Kit, Cat. No. D4050).
Cho 250µl Binding Buffer vào 10µl sản phẩm Sequencing, trộn đều bằng pipet.
Chuyển toàn bộ hỗn hợp dịch lên cột tách. Ly tâm 13.000 rpm/1phút.
Chuyển cột tách sang ống eppenforf 2ml mới, sạch.
Cho 20µl nước vào cột tách, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, ly tâm 13.000 rpm/30 giây. Ta thu được sản phẩm để chạy điện di.
Chuyển toàn bộ sản phẩm này sang plate, cho vào máy giải trình tự gen.