2.3.2.1. Thiết bị
Cân điện , Lò vi sóng, Tủ sấy, Tủ hấp, Tủ ấm, Tủ cấy vô trùng, Tủ lạnh
2.3.2.2. Dụng cụ
- Que cấy thẳng, que cấy vòng, Đèn cồn, Đĩa petri, Thước đo mm, Bình cầu, Ống nghiệm, Giá đỡ ống nghiệm, Kẹp, Tăm bông vô trùng, Bông thấm và không thấm nước
2.3.3.1. Phân lập và định danh
- Các chủng giống được cấy trong ống thạch NA giữ chủng lưu trữ tại phòng
thí nghiệm bộ môn Vi sinh trường Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh. Việc cấy giống trong các hộp thạch được thực hiện ở bệnh viện sau đó được đưa về phòng thí nghiệm lưu trữ. Tuy đã được sơ bộ định danh tại cơ sở nhưng để đảm bảo độ chính xác chúng tôi tiến hành cấy phân lập lại và định danh. Khi tiến hành khảo sát thì chúng tôi tăng sinh trong thời gian 16 – 18h bằng môi trường BHI. Sau đó cấy phân lập trong các hộp thạch EMB và ủ 35oC trong 18 – 24h.
- Thực hiện cấy vi khuẩn trên các môi trường định danh.
- Đọc kết quả trên môi trường định danh, làm các phản ứng sinh hóa và dựa
theo tính chất này để định danh vi khuẩn.
+ Môi trường TSI: có chất chỉ thị màu phenol red.
- Nếu vi khuẩn chỉ sử dụng đường glucose thì phần đứng môi
trường có màu vàng.
- Nếu vi khuẩn sử dụng cả hai loại đường glucose và lactose thì cả môi trường phần đứng và phần nghiêng đều có màu vàng.
- Nếu vi khuẩn sinh hơi thì phần thạch sẽ bị nứt hoặc có bóng
hơi.
- Nếu vi khuẩn sinh H2S thì sẽ làm môi trường có màu đen. + Môi trường manitol: Nếu vi khuẩn sử dụng đường manitol thì môi trường có màu vàng.
+ Môi trường SIM:
- Nếu vi khuẩn sinh H2S thì làm môi trường có màu đen.
- Nhỏ 2 – 3 giọt thuốc thử Kovac’s vào ống nghiệm, phản ứng
dương tính khi xuất hiện vòng màu đỏ.
- Nếu vi khuẩn di động thì vi khuẩn mọc lan quanh đường cấy
như rễ cây hoặc làm đục môi trường.
+ Môi trường Citrate: Nếu vi khuẩn có khả năng phân giải natri citrate sẽ làm biến đổi màu môi trường từ xanh lá cây sang xanh dương thẫm.
+ Thử nghiệm urease: Nếu vi khuẩn sinh enzim urease thì làm cho môi trường có màu đỏ.
+ Thử nghiệm PAD: Nhỏ 5 giọt FeCl3 vào ống nghiệm, nếu vi khuẩn
sinh phenylalanine deaminase, thì môi trường sẽ chuyển sang màu xanh. - Định danh vi khuẩn.
2.3.3.2. Làm kháng sinh đồ theo phương pháp khuếch tán
- Thực hiện sau khi định danh vi khuẩn.
- Kháng sinh sử dụng theo hướng dẫn của CLSI (Phụ lục), đặt các kháng
sinh Ampicillin, Cefazolin , Cefuroxime , Cefepime, Cefoperazone, Cefoxitin, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Imipenem, Meropenem, Getamicin, Amikacin, Neltimicin, Tobramycin,
Tetracyline, Ciprofloxacin, Levofloxacin, Trimethoprim –sulfamethoxazole, Cloramphenicol, Ceftriaxone, Aztreonam, Ceftazidime, , Ceftotaxime, Amox - acid clavulanic, Piperacillin-tazobactam, Ticarcilin acid.
- Sử dụng phương pháp Kirby – Bauer: Kháng sinh tẩm vào đĩa giấy với nồng độ quy định theo tiêu chuẩn quốc tế sẽ khuếch tán vào thạch, ức chế sự phát triển của vi khuẩn, tạo thành vòng vô khuẩn; đo đường kính vô khuẩn xuất hiện
quanh đĩa giấy kháng sinh để xác định sự nhạy cảm hay đề kháng của vi khuẩn với
kháng sinh đã dùng.
- Môi trường được cân, cho lượng nước cất thích hợp vào bình tròn, nấu tan. Sau đó phân ra các đĩa petri với độ dày thạch chừng 4mm. Sau đó ủ môi trường ở 35oC trong vòng 24h để loại trừ các hộp thạch bị nhiễm khuẩn.
- Dùng que cấy lấy khúm vi khuẩn cho vào trong ống nghiệm chứa dịch BHI
và để khoảng 15- 20 phút để tăng sinh. Lượng vi khuẩn lấy sao cho khi cho vào ống
BHI thì có độ đục tương đương 108 vi khuẩn/ml (So sánh với độ đục chuẩn: Mc
Farland 0.5).
- Dùng tăm bông vô trùng nhúng vào dịch, ép hết nước thừa trên thành ống
- Dùng kẹp vô trùng lấy các đĩa kháng sinh và đặt lên trên mặt thạch sao cho mặt đĩa kháng sinh tiếp xúc đều với mặt thạch. Các đĩa kháng sinh cách mép hộp thạch từ 2 – 2,5cm và cách nhau 2,5 – 3,5cm.
- Ủ 37oC trong vòng 18 – 24h.
- Đọc kết quả kháng sinh đồ: Đo đường kính vòng vô khuẩn và dựa theo tiêu
chuẩn CLSI để xác định mức độ là nhạy cảm (S: susceptible), trung gian (I: intermediate), và kháng (R: resistant)
2.3.3.3. Kỹ thuật phát hiện vi khuẩn sinh ESBL
Thực hiện đồng thời với làm kháng sinh đồ.
- Xét nghiệm sàng lọc: Dùng kháng sinh chỉ điểm là Ceitazidime 30µg, Cefotaxime 30µg, Ceftriaxone 30µg.
- Xét nghiệm xác định: Dùng phương pháp đĩa kết hợp với 2 loại đĩa giấy
kháng sinh là Ceftazidime – acid clavulanic 30/10µg và Cefotaxime – acid clavulanic 30/10µg.
- Chứng: K. pneumoniae ATCC 700603 (Chứng dương) và E. coli ATCC
25922 (Chứng âm).
Kỹ thuật thực hiện tương tự như kỹ thuật làm kháng sinh đồ.
Đọc kết quả ESBL: Đo đường kính vòng vô khuẩn và dựa theo tiêu chuẩn CLSI để xác định vi khuẩn sinh ESBL.
2.4. Xử lý số liệu
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tỉ lệ vi khuẩn Gram âm đường ruột thường gặp sinh ESBL
Bảng 3.1. Tỉ lệ các loại vi khuẩn Gram âm đường ruột thường gặp phân lập được(127 chủng)
Số lượng Tỉ lệ (%)
VKDR có sinh ESBL 68 53,5 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
VKDR không sinh ESBL 59 46,5
Biểu đồ 3.1. Tỉ lệ vi khuẩn Gram âm đường ruột thường gặp sinh ESBL
Kể từ khi hiện tượng ESBL bắt đầu xuất hiện ở Tây Âu cho đến nay đã được phát hiện ở nhiều nơi trên thế giới như Mỹ, Châu Á. Tần suất xuất hiện vi khuẩn
sinh ESBL thay đổi tùy theo quốc gia. Trong cùng một quốc gia thì cũng có sự thay
đổi tùy từng bệnh viện.
- Ở Châu Á, tỉ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL vẫn còn thấp. Ở Hàn Quốc,
tỉ lệ này là 4,8% [75], trong khi đó, ở Đài Loan là 8,5% [103] và 12% tại Hồng Kông
[42] . Tại Ả Rập Xêut, nghiên cứu trên 3231 vi khuẩn Gram âm cho thấy tỉ lệ sinh ESBL là 4,8%[48], tại Ấn Độ là 26,6% [37].
- Tại Việt Nam: Năm 2000 – 2001, các tác giả Cao Bao Van, Duong Quynh Nhu, Huynh Kim Loan, Nguyen Kim Hoang, Quillanme Alrlet và Patrice
Cuourvalin nghiên cứu sự nhạy cảm của 1309 chủng vi khuẩn (730 chủng E. coli,
438 chủng K. pneumoniae, 141 chủng P. mirabilis) với ceftazidime, Ceftotaxime,
Ceftriazone, Cefoperazone, Cefepime và Imipemem bằng E – test và bằng phương pháp đĩa đôi. Kết quả có 7,5% chủng sinh ESBL [97].
- Năm 2004, tác giả Nguyễn Thị Ngọc Huệ và cộng sự tại bệnh viện đa khoa
Bình Định nghiên cứu và nhận thấy có 22% số chủng có sinh ESBL [13].
- Năm 2005, Chu Thị Nga và các cộng sự đã nghiên cứu trên 117 chủng E.
coli, Klebsiella, Enterobacter phân lập tại bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng đã phát hiện 34/117 chủng sinh ESBL chiếm tỉ lệ 29,06% [17].
- Năm 2007, Tác giả Vũ Thị Kim Cương thực hiện nghiên cứu từ tháng 10/
2004 – 6/2005 tại bệnh viện Thống Nhất, thì có 46 vi khuẩn đường ruột sinh ESBL
trên tổng số 105 chủng vi khuẩn đường ruột phân lập được chiếm tỉ lệ là 43,8%[20].
- Năm 2008, tác giả Mai Văn Tuấn nghiên cứu ở bệnh viện trung ương Huế
từ tháng 10 – 12/2006, nhận thấy có 65 chủng vi khuẩn Gram âm sinh ESBL trên tổng số 214 vi khuẩn Gram âm phân lập được, chiếm tỉ lệ 30,4% [21].
- Năm 2009, Tác giả Hoàng Thị Phương Dung thực hiện nghiên cứu từ tháng
7/2008 đến tháng 12/2008 tại bệnh viện Đại Học Y Dược T.p Hồ Chí Minh nhận thấy có 32,4% vi khuẩn sinh ESBL trên tổng số 204 chủng vi khuẩn gram âm khảo sát[8].
Theo nghiên cứu của chúng tôi trong 127 chủng vi khuẩn đường ruột phân lập được, có 68 chủng vi khuẩn sinh ESBL, chiếm tỉ lệ 53,5%. Sở dĩ có tỉ lệ cao như vậy là do đối tượng khảo sát của chúng tôi tập trung vào 4 chủng vi khuẩn Gram âm đường ruột thường gặp là E. coli, Klebsiella, Enterobacter, Proteus. So với nghiên cứu của tác giả Vũ Thị Kim Cương thì nghiên cứu của tôi gần tương đương nhau do đối tượng sinh ESBL mà tác giả khảo sát cũng là các vi khuẩn đường ruột. So với nghiên cứu của tác giả Hoàng Thị Phương Dung và tác giả Mai Văn Tuấn thì tỉ lệ vi khuẩn sinh ESBL của chúng tôi có cao hơn do 2 tác giả trên khảo sát tỉ lệ sinh
ESBL của các vi khuẩn Gram âm, nên đối tượng khảo sát rộng hơn của chúng tôi.
Tuy nhiên, nghiên cứu cũng chỉ ra được sự gia tăng tỉ lệ các vi khuẩn sinh ESBL
ngày càng cao.
3.2. Tỷ lệ các chủng vi khuẩn Gram âm đường ruột thường gặp sinh ESBL Bảng 3.2. Tỉ lệ các vi khuẩn Gram âm đường ruột thường gặp sinh ESBL Bảng 3.2. Tỉ lệ các vi khuẩn Gram âm đường ruột thường gặp sinh ESBL
Vi khuẩn TS. K. sát ESBL+ Tỉ lệ (%) ESBL - Tỉ lệ (%)
E. coli 45 22 32,4 23 39,0 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Klebsiella spp. 76 45 66,2 31 52,5
Enterrobacter spp. 1 0 0,0 1 1,7
Proteus spp. 5 1 1,5 4 6,8
Tổng số 127 68 53,5 59 46,5
Biểu đồ 3.2. Tỉ lệ các chủng vi khuẩn Gram âm đường ruột thường gặp sinh ESBL
- Hiện nay, y học đang phải đối phó với các vi khuẩn Enterobactericeae như:
E. coli, Klebsiella, Enterobacter, Proteus, ... tiết enzim β – lactamase phổ rộng đề kháng các kháng sinh nhóm Cephalosporin thế hệ 3, 4. Tại Việt Nam đã có nhiều
Proteus,... sinh ESBL chiếm tỉ lệ khá cao. Trong đó, E. coli và K. pneumoniae
chiếm tỉ lệ cao nhất.
- Nghiên cứu của SENTRY năm 1997 – 1998, tỉ lệ K. pneumoniae ở Mỹ sinh
ESBL là 7,6 % so với 4,9% ở Canada. Tỉ lệ E. coli sinh ESBL là 4,2% ở Mỹ và
3,3% ở Canada [99] [47] . Một nghiên cứu của Moland và các cộng sự vào năm 2001 –
2002 trên khắp nước Mỹ đã chỉ ra rằng tỉ lệ sinh ESBL ở K. pneumoniae là 11,3%
và ở E. coli là 2,6%[65].
- Ở Châu Âu, tỉ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL cũng thay đổi theo từng
quốc gia. Tại Hà Lan, một nghiên cứu trên 11 phòng thí nghiệm vào năm 1999 cho thấy <1% E. coli và K. pneumoniae có sinh ESBL[79]. Tuy nhiên, các nghiên cứu ở
Pháp lại chỉ ra rằng, có đến 40% các chủng K. pneumoniae phân lập được kháng
ceftazidime [31]. Trên khắp Châu Âu, tỉ lệ K. pneumoniae kháng ceftazidime là 20% ở các cơ sở điều trị thông thường và 42% ở các cơ sở chăm sóc đặc biệt [79].
- Ở Châu Á, tỉ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL vẫn còn thấp, ở mức <0,1% đối với E. coli và 0,3% đối với K. pneumoniae trong các nghiên cứu trên khắp Nhật Bản [102]. Ở Thái Lan (2006) có: 26,3% E. coli, 21% K. pneumoniae sinh ESBL [25]. Tác giả Yoichi Hirakata và cộng sự thực hiện nghiên cứu trên 17 trung tâm Y Khoa ở 7 quốc gia thuộc vùng Châu Á Thái Bình Dương từ 1998 – 2002 đã xác định được
trong 6388 chủng (Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli,
Proteus mirabilis, Citrobacter koseri, Samonella spp. ) phân lập được sinh ESBL
thì chủng K. pneumoniae chiếm tỉ lệ cao nhất là Singapore chiếm 35,6%, tiếp theo
là Trung Quốc với 30,7%, Nam Á là 28,1%, Philippines là 21,9%. Trong khi tỉ lệ
này thấp hơn ở Nhật và Úc (10%). Chủng E. coli sinh ESBL cũng nổi bật ở Trung
Quốc (24,5%), Hồng Kông (14,3%), Singapore (11,3%) [104].
- Tại Việt Nam: Năm 2000 – 2001, các tác giả Cao Bao Van và cộng sự,
trong 55 chủng vi khuẩn sinh ESBL phân lập được, có 32 chủng E. coli chiếm tỉ lệ
58,2%, 13 chủng K. pneumoniae chiếm tỉ lệ 23,6% và 10 chủng P. mirabilis chiếm
- Nghiên cứu tại bệnh viện trung ương Huế (2006) của Mai Văn Tuấn nhận thấy có 41,5% E. coli; 23,1% K. pneumoniae sinh ESBL [21].
- Trong nghiên cứu SMART 2006 – 2007, trong 125 chủng E. coli có 38 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
chủng sinh ESBL chiếm tỉ lệ 30,4%, trong 33 chủng K. pneumoniae có 10 chủng
sinh ESBL chiếm tỉ lệ 30,3% [16].
- Nghiên cứu tại bệnh viện Thống Nhất (2007), tác giả Vũ Thị Kim Cương :
K. pneumoniae chiếm tỉ lệ cao nhất (53,4%)[6]. Đồng thời, năm 2005, tác giả Hoàng Kim Tuyến và cộng sự cũng khảo sát các vi khuẩn sinh ESBL, kết quả cho thấy tỉ lệ sinh ESBL cao nhất cũng là K. pneumoniaevới 18% và E. coli là 17,7% [20].
- Nghiên cứu tại bệnh viện Đại Học Y Dược (2009), tác giả Hoàng Thị Phương Dung có 55,3% E. coli và 21,3% K. pneumoniae sinh ESBL[8].
- Trong nghiên cứu của chúng tôi thì tỉ lệ vi khuẩn Klebsiella sinh ESBL là cao nhất trong số các chủng vi khuẩn sinh ESBL phân lập được (66,2%) cao hơn cả tỉ lệ chung (53,5%). Tỉ lệ E. coli sinh ESBL là 32,4%. Tiếp theo là Proteus spp. chiếm tỉ lệ 1,5%. Tuy nhiên, tại bệnh viện 175 nghiên cứu được chỉ có 5 chủng
Proteus spp trong đó chỉ có 1 chủng sinh ESBL. Vì thế, tỉ lệ này chỉ có giá trị tham khảo.
3.3. Tỉ lệ kháng kháng sinh của một số chủng vi khuẩn Gram âm đường ruột thường gặp sinh ESBL thường gặp sinh ESBL
Trong số 127 chủng vi khuẩn Gram âm thường gặp phân lập được tại bệnh viện 175 thì E. coli và Klebsiella spp. chiếm tỉ lệ cao nhất. Trong đó có 22/45 chủng
E. coli sinh ESBL, 45/76 chủng Klebsiella spp. sinh ESBL. Trong quá trình phân lập và định danh, chúng tôi chỉ thực hiện định danh đến giống Klebsiella. Do đó, chúng tôi đặt các chủng Klebsiellaphân lập được đại diện là Klebsiella spp. Song song đó, kĩ thuật xác định ESBL chúng tôi cũng thực hiện đồng thời với việc khảo sát sự kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn theo khuyến cáo của CLSI. Vì vậy, đối với mỗi chủng khảo sát chúng tôi khảo sát 24 loại kháng sinh, kể cả các kháng sinh đã được công bố trong các công trình nghiên cứu trước mà các chủng vi khuẩn sinh ESBL đề kháng.
Bảng 3.3. Tỉ lệ kháng kháng sinh của một số chủng vi khuẩn Gram âm đường ruột thường gặp sinh ESBL
Kháng sinh E. coli Klebsiella spp. n = 22 n = 45 SL TL(%) SL TL(%) Ampicillin 22 100,0 44 97,8 Amoxicillin/clavulanic acid 3 13,6 18 40,0 Piperacillin- tazobactam 6 27,3 17 37,8 Ticarcillin-clavulanic acid 3 13,6 13 28,9 Cefazolin 21 95,5 44 97,8 Cefuroxime 21 95,5 40 88,9 Cefepime 14 63,6 28 62,2 Cefoperazone 20 90,9 37 82,2 Cefoxitin 3 13,6 17 37,8 Cefotaxime 16 72,7 7 15,6 Ceftriaxome 17 77,3 35 77,8 Ceftazidime 11 50,0 37 82,2 Imipenem 0 0,0 0 0,0 Meropenem 1 4,5 0 0,0 Aztreonam 14 63,6 32 71,1 Gentamicin 13 59,1 33 73,3 Amikacin 7 31,8 14 31,1 Netilmicin 4 18,2 17 37,8 Tobramycin 16 72,7 37 82,2 Tetracycline 20 90,9 40 88,9 Ciprofloxacin 19 86,4 34 75,6 Levofloxacin 18 81,8 29 64,4 Trimethoprim/ Sulfamethoxazole 20 90,9 39 86,7 Chloramphenicol 15 68,2 33 73,3
3.3.1. Tỉ lệ kháng kháng sinh của E. coli
Biểu đồ 3. 3. Tỉ lệ kháng kháng sinh nhóm β – lactam của E. coli sinh ESBL
* Kháng kháng sinh nhóm β – lactam :
+ Kháng sinh thuộc nhóm Penicillin: [13,6% - 100%]
+ Kháng sinh thuộc nhóm Cephalosporin: [13,6% - 95,5%]
+ Kháng sinh nhóm Carbapenems: [0 – 4,5%] + Kháng sinh thuộc nhóm monobactams: [63,6%]
Trong nghiên cứu này thì Ampicillin hầu như không còn tác dụng đối với E.
coli. Như trên biểu đồ 3.5 ta cũng thấy rõ tỉ lệ kháng là 100%. Kết quả trên cũng
tương tự với nghiên cứu của các tác giả Hoàng Thị Phương Dung (97,9%) [8] và tác
giả Phạm Hùng Vân (99%) [21]. Tuy nhiên đối với các kháng sinh thuộc nhóm penicillin có bổ sung thêm chất ức chế β – lactamase thì tỉ lệ kháng thấp (13,6 –
27,3%). Kết quả trên càng củng cố nhận định rằng các vi khuẩn sinh ESBL có khả
năng kháng các kháng sinh nhóm Cephalosporins thế hệ thứ 3, 4.
Điều đáng quan tâm là sự kháng các kháng sinh thuộc nhóm carbapenems, theo ASTS 2006 thì có 1,5% vi khuẩn kháng Imipenem [20], theo tác giả Vũ Thị Kim Cương thì tỉ lệ kháng Imipenem là 2,6%[6]. Còn trong nghiên cứu của tôi
không có vi khuẩn nào kháng Imipenem. Song, điểm khác biệt là trong các nghiên