Nguyên tắc xét nghiệm ESBLs trong vi sinh lâm sàng gồm 2 bước [2][56]: - Bước 1: Xét nghiệm sàng lọc
- Bước 2: Xét nghiệm xác định
* Xét nghiệm sàng lọc:Chọn lựa cephalosporin(s) chỉ điểm. Mục đích là khảo sát sự đề kháng hay giảm nhạy cảm trong những xét nghiệm sàng lọc với cephalosporin(s) chỉ điểm, nhờ đó phát hiện các chủng có thể có ESBLs [72]. Do đó, nếu càng sử dụng nhiều cephalosporin thì càng có nhiều cơ hội phát hiện những kiểu kháng thuốc ít gặp. Các kháng sinh được khuyên dùng để thử nghiệm các
chủng thuộc họ Enterobacteriaceae là cefpdoxime, ceftazidime, aztreonam,
gãy (BP: Breakpoint) của một trong những kháng sinh ở trên thì có thể chỉ điểm chủng vi khuẩn sinh ESBL. Khi đó, sẽ làm tiếp bước 2.
* Xét nghiệm xác định: Xét nghiệm xác định ESBLs dựa vào tìm kiếm sự cộng hưởng giữa oxymino – cephalosporin và clavulanate. Nhờ đó phân biệt các chủng ESBLs (cộng hưởng dương) khỏi các chủng kháng thuốc vì nhiều lý do khác (cộng hưởng âm); vì clavulanate có tác dụng ức chế ESBLs. Nhiều phương pháp phát hiện ESBLs được đề nghị dựa trên nguyên tắc đĩa khuyếch tác của Kirby – Bauer. Hiện nay, các phương pháp cộng hưởng đang được sử dụng rộng rãi là: Phương pháp đĩa đôi, phương pháp đĩa kết hợp và phương pháp E – test.
- Phương pháp đĩa đôi: Phương pháp này được mô tả bởi Jarlier và
cộng sự (1988) [79] [76] [12] . Dựa trên nguyên tắc clavulanic acid ức chế ESBL nên làm giảm mức độ đề kháng của cephalosporins và mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa kháng sinh cephalosporins khi đặt gần một đĩa kháng sinh chứa clavulanic acid [79] [51] [76] [12]. Vi khuẩn được cấy trên đĩa thạch Mueller – Hinton. Đặt đĩa cephalosporin (30µg) với đĩa amoxicillin – clavulanate (20µg) cách nhau 20 – 25mm trên mặt thạch. Trước đây, khoảng cách yêu cầu là 30mm, nhưng hiện nay, khoảng cách được giảm xuống để tăng độ nhảy cảm của phương pháp. Có cộng hưởng khi có sự mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa cephalosporin ở vùng giao tiếp với đĩa chứa clavulanate. Ưu điểm của phương pháp này là dễ thực hiện. Nhưng khuyết điểm là có thể bỏ sót một số chủng vi khuẩn có ESBL.
Hình 1.6. Phương pháp đĩa đôi phát hiện ESBLs
- Phương pháp đĩa kết hợp [39] [4]: Phương pháp này được Jacoby và Hans mô tả lần đầu tiên vào năm 1999. Bằng cách sử dụng hai loại đĩa kháng sinh là cephalosporins thế hệ 3 và cephalosporins thế hệ 3 tương ứng phối hợp với clavulanic acid. Vi khuẩn tiết ESBL khi hiệu số đường kính vòng vô khuẩn của đĩa cephalosporins có phối hợp với clavulanic acid so đĩa cephalosporins ≥5mm. Các loại đĩa kháng sinh được sử dụng là cefotaxime (30µg)/ cefotaxime – clavulanic acid (30/10µg); ceftazidime (30µg)/ ceftazidime – clavulanic acid (30/10µg); cefpodoxime (10 µg)/ cefpodoxime (10/10 µg).
Hình 1.7. Phương pháp đĩa kết hợp phát hiện ESBLs
Tiêu chuẩn CLSI yêu cầu mới phương pháp này cần phải thực hiện đồng thời trên cả hau hệ thống là : cefotaxime (30µg)/ cefotaxime – clavulanic acid
(30/10µg); ceftazidime (30µg)/ ceftazidime – clavulanic acid (30/10µg); Phương pháp này dễ thực hiện và ít tốn kém nhưng yêu cầu phòng thí nghiệm phải có đĩa
kháng sinh cefotaxime – clavulanic acid và ceftazidime – clavulanic acid. Một số
trường hợp cho kết quả dương tính giả do một số vi khuẩn sinh AmpC cũng xuất hiện sự gia tăng đường kính vòng vô khuẩn khi có clavulanic acid.
- Phương pháp E – test: Dùng que E – test (AB Biodisk, Solna,
Sweden), một đầu là dãy chứa nồng độ của cephalosporin và đầu đối diện là dãy
nồng độ của cephalosporin / clavulanic acid. Khi đầu chứa clavulanic acid cho MIC giảm ≥ 8 lần so với đầu còn lại thì suy ra được rằng vi khuẩn có sinh ESBL. Phương pháp này cho kết quả chính xác nhưng giá thành khá cao.
Hình 1.8. Phương pháp E – test phát hiện ESBLs
Ngoài 3 phương pháp phát hiện ESBL được sử dụng rộng rãi trên thì cũng có một số phương pháp khác được sử dụng trong các phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng như : Phương pháp thử nghiệm 3 chiều (three-dimensional test) được mô tả bởi Thomson and Sanders, phương pháp Vitek ESBL test (Biomerieux, Hazlewood, Mo.) Tuy nhiên hiệu quả của 2 phương pháp trên không cao.
Ngày nay, ngoài các kĩ thuật trong vi sinh lâm sàng thì các kĩ thuật xác định ESBLs bằng sinh học phân tử cũng đang được ứng dụng rộng rãi.
Bảng 1.9. Một số phương pháp phân tử xác định ESBL[79]
Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm
Dò ADN Cho kết quả chính xác với các
nhóm gen (VD: TEM, SHV)
Đòi hỏi kĩ thuật cao, chưa phân biệt được các ESBL và không ESBL, không phân biệt được các biến thể của TEM, SHV
PCR
Dễ thực hiện. Cho kết quả chính xác với các nhóm gen (VD: TEM, SHV)
Chưa phân biệt được các ESBL
và không ESBL, không phân biệt được các biến thể của TEM, SHV
Oligotyping Phát hiện các biến thể TEM cụ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thể Đòi hỏi kĩ thuật cao
Trình tự nucleotid
Các tiêu chuẩn vàng, có thể phát hiện ra các biến thể
Đòi hỏi kĩ thuật cao, chuyên sâu.