Chương 2 đỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
* Vật liệu nghiên cứu
- Mẫu phân gà nghi mắc bệnh cầu trùng
- Máu của gà bị nhiễm cầu trùng sau khi ựược gây bệnh thắ nghiệm - Xác gà chết do mắc bệnh cầu trùng sau khi ựược gây bệnh thắ nghiệm - Các ựoạn ruột của gà mắc bệnh cầu trùng sau khi chết gồm: ruột non (tá tràng, không tràng, hồi tràng) và ruột già (manh tràng, kết tràng, trực tràng)
- Dụng cụ phục vụ cho nghiên cứu: Tủ lạnh, tủ ấm 28ồC, tủ ấm 37ồC, máy ựúc Block, máy cắt Microton, kắnh hiển vi quang học, máy ly tâm, vòng vớt, lọ thủy tinh, phiến kắnh, lá kắnh, dao mổ, pank, kẹp, hộp lồng, xi lanh, kim lấy máu, buồng ựếm Mc. Masteur...
- Hóa chất dung cho nghiên cứu:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
+ Dung dịch Bichromate kali 2,5%
+ Hóa chất, môi trường dùng ựể bảo quản mẫu: formol 10%
+ Hóa chất dùng ựể nhuộm tiêu bản: nước cất, cồn ở các nồng ựộ, xylen, thuốc nhuộm Haematoxylin, Eosin.
* Phương pháp nghiên cứu
ạ Phương pháp ựiều tra dịch tễ học
Theo phương pháp và công thức dịch tễ học, các mẫu ựược lấy ngẫu nhiên, ựảm bảo tắnh khoa học và phân bố ựều trên các ựối tượng nghiên cứụ
Bố trắ lấy mẫu: để xác ựịnh tỷ lệ nhiễm bệnh cầu trùng tại 4 huyện Việt Yên, Yên Thế, Tân Yên và Lạng Giang của tỉnh Bắc Giang.
Tình hình chăn nuôi: Những xã chăn nuôi gà nhiều và phân bố ựều theo các vùng trong huyện.
Dịch bệnh: Gà con ở giai ựoạn 2 Ờ 8 tuần tuổi mẫn cảm ựối với bệnh. Trên cơ sở ựánh giá sơ bộ tình hình thực tế của từng huyện chúng tôi bố trắ lấy mẫu như sau:
Tên huyện Tên xã Số mẫu lấy trong
mỗi huyện
Việt Yên Hồng Thái, Tự Lạn, Tân Trung, Quang
Châu 455
Yên Thế Tân Sỏi, TT Cầu Gồ, Tam Hiệp, Tam Tiến 455
Tân Yên Cao Xá, Quang Tiến, An Dương, Liên
Sơn 455
Lạng Giang Tiên Lục, Hương Lạc, đại Lâm, Quang
Thịnh 450
Tắnh chung 1815
- Qui ựịnh một số yếu tố liên quan ựến dịch tễ của bệnh
Lứa tuổi của gà: ựược chia làm 7 lứa tuổi, ựược thực hiện trong cả 4 huyện với số lượng mẫu như sau:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31
Tuổi của gà (tuần) Số lượng mẫu lấy
2 252 3 256 4 260 5 265 6 266 7 259 8 257 Tắnh chung 1815
- đánh giá theo phương thức chăn nuôi:
Phương thức chăn nuôi Số lượng
mẫu lấy
+ Thả vườn (nuôi thả tự do) 600 + Bán công nghiệp (kết hợp thức ăn tận dụng với cám công nghiệp 605 + Công nghiệp (trang trại) 610
Tắnh chung 1815
b. Phương pháp thu nhận mẫu
- Mẫu phân: Chúng tôi lấy mẫu phân vừa thải ra của gà ở các lứa tuổi (từ 2 tuần ựến 8 tuần tuổi). để riêng các mẫu phân vào một túi nilon nhỏ, bên ngoài mỗi túi ghi rõ: Tuổi gà, ựịa ựiểm, tình trạng vệ sinh, phương thức chăn nuôi ngày tháng lẫy mẫu và các biểu hiện lâm sàng khác của gà. Các mẫu ựược xét nghiệm ngay trong ngày (nếu chưa kịp xét nghiệm sẽ ựược bảo quản ở nhiệt ựộ 4ồC Ờ 6ồC, không quá 3 ngày).
- Mẫu phủ tạng: Sau khi gây nhiễm thực nghiệm, chúng tôi mổ khám gà chết và thu mẫu phủ tạng gồm tá tràng, hồi tràng và trực tràng. Mẫu tổ chức ngâm bảo quản trong formol 10% ựể làm tiêu bản vi thể.
- Mẫu máu: Chúng tôi tiến hành lấy máu ở tim của gà bị mắc bệnh cầu trùng 7 ngày sau khi gây nhiễm, thời ựiểm lấy máu vào buổi sáng sớm trước khi
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32
cho gà ăn.
c. Phương pháp xét nghiệm mẫu phân và thu noãn nang
- Phương pháp Fulleborn:
Cho 5 Ờ 10 gram phân gà cần xét nghiệm vào cốc, cho lượng nước muối bão hòa gấp 10 Ờ 20 lần phân, khuấy ựềụ Lọc bỏ phân qua rổ lọc có lưới thép, lọc vào một cốc khác. đổ dịch ựã lọc vào lọ thủy tinh (miệng nhỏ hơn ựáy), tiếp tục thêm lượng nước muối bão hòa sao cho ựến miệng lọ (tránh ựể tràn ra ngoài). để yên tĩnh khoãng 20 phút ựến 30 phút, dùng vòng vớt có kắch 0,3 mm vớt phần váng bên trên ựặt lên phiến kắnh rồi soi dưới kắnh hiển vi tìm noãn nang.
- Phương pháp Daugschies (lắng ựọng và phù nổi noãn nang)
Cho phân vào cốc, thêm lượng nước vừa phải vào phân rồi khuấy ựềụ Lọc bỏ phân qua rổ lọc có lưới thép, phần dịch lọc thu ựược ựem ly tâm với tốc ựộ 4000 vòng/phút trong 5 phút, sau ựó loại bỏ phần nước trong bên trên, cho nước muối bão hòa, khuấy ựều, ựể yên tĩnh 20 phút, sau ựó ựem ly tâm như trên, loại bỏ cặn lấy phần dịch trong bên trên rồi cho thêm nước vào ựó tiếp tục ựem ly tâm như trên. đổ loại bỏ nước trong bên trên, hút dung dịch K2Cr2O7 2.5% cho vào phần kết tủa thu ựược (noãn nang), rồi hút ra hộp lồng Petrị Dùng miếng nilon có ựục nhiều lỗ nhỏ, bịt vào miệng hộp lồng Petri, cố ựịnh chặt lại ựem ựể tủ ấm ở 29ồC/20-22h, thỉnh thoảng lắc nhẹ. Kiểm tra tình trạng phát triển của noãn nang, nếu noãn nang phát triển tốt thì chuyển toàn bộ dung dịch ở hộp lồng Petri vào lọ thủy tinh (lúc này noãn nang ở dạng sporulation Ờ dạng dùng ựể gây bệnh thực nghiệm), bảo quản ở nhiệt ựộ 4 Ờ 6ồC cho ựến khi dùng. Tuy nhiên trong 3 tháng nên gây bệnh thực nghiệm qua gà 1 lần ựể ựảm bảo sức gây bệnh.
- Phương pháp ựánh giá tỷ lệ nhiễm cầu trùng:
Tỷ lệ nhiễm cầu trùng (%) = (Số mẫu dương tắnh/Số mẫu kiểm tra) ừ 100
d. Phương pháp tách noãn nang cầu trùng chủng Eimeria tenella
Theo các nghiên cứu ựã ựược công bố thì chủng Ẹ tenella gây bệnh chủ yếu, biểu hiện bệnh lý nặng nhất và làm thiệt hại kinh tế trong chăn nuôi gà ựáng kể nhất. Trước hết chúng tôi tiến hành tách các chủng cầu trùng khác nhau dựa trên noãn nang thu ựược từ các mẫu phân:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33
Trước khi gây nhiễm cho gà, oocyst ở dạng bào tử dự trữ trong dung dịch
potassium dichromate (K2Cr2O7 2,5%) ở 4ồC ựược rửa bằng dung dịch PBS -
phosphate buffer saline (300 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.7 mM NaH2PO4) với phương pháp ly tâm ựể loại bỏ dichromate potassium (Shirley, 1995), sau ựó oocyst ựược xử lý bằng dung dịch sodium hypochlorite 5.75% và ngâm trong nước ựá 30 phút ựể loại bỏ các tạp chất khác (Zhao et al., 2001). Tiếp ựó dung dịch oocyst ựược pha loãng ở nồng ựộ 10 oocyst/ml nước, tiến hành hút 0,1ml dung dịch trên lên phiến kắnh và soi dưới kắnh hiển vị Nếu trong ựó chứa 1 noãn nang
Ẹ tenella ở dạng sporulation thì hút lại và cho 1 gà uống (Dongjean et al., 2011), chúng tôi tiến hành thắ nghiệm với 20 gà. Số gà trên ựược nuôi cách ly riêng biệt trên 20 hộp giấy khác nhau ựể tránh tạp nhiễm các chủng khác (Khalafalla and Daugschies, 2010). Sau 4 Ờ 6 ngày các mẫu phân của 20 gà trên ựược kiểm tra tình trạng nhiễm cầu trùng, các mẫu có xuất hiện noãn nang sẽ ựược tiến hành thu oocyst bằng phương pháp phù nổi và lắng cặn (Daugschies et al., 2002). Rồi tiến hành ựể oocyst phát triển thành dạng bào tử, soi oocyst trên kắnh hiển vi ựể kiểm tra chủng, tiếp tục ựược gây nhiễm cho số gà mới với liều lớn hơn ựể tăng số lượng ựủ cho gây bệnh thực nghiệm.
ẹ Phương pháp gây bệnh thực nghiệm
Thiết kế thắ nghiệm: Chúng tôi chọn 40 gà 14 ngày tuổi khỏe mạnh (Không có biểu hiện lâm sàng của bệnh, xét nghiệm phân không có cầu trùng, ăn uống, hoạt ựộng bình thường). Số gà trên ựược chia thành 2 lô (lô thắ nghiệm và lô ựối chứng, mỗi lô 20 gà).
đối với nhóm gà thắ nghiệm: cho gà uống khoảng 1 ml dung dịch noãn nang (105) có sức gây bệnh, hàng ngày theo dõi các biểu hiện của gà và sau 4 Ờ 7 ngày lấy phân xét nghiệm tìm noãn nang.
Thời ựiểm lấy máu xét nghiệm: Chúng tôi tiến hành lấy máu của gà bệnh vào thời ựiểm 7 ngày sau khi gây nhiễm, trước khi gà chết. đồng thời tại thời ựiểm lấy máu chúng tôi tiến hành kiểm tra phân gà cho thấy mật ựộ noãn nang trung bình là 5,7 ừ 105/1g phân.
g. Phương pháp xác ựịnh các ựặc ựiểm bệnh lý
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34
sàng thường quỵ
- Mổ khám gà bị bệnh ựể kiểm tra bệnh tắch ựại thể
- Xác ựịnh bệnh tắch vi thể chúng tôi lấy mẫu và nhuộm tiêu bản theo phương pháp HE
- Các mẫu thu nhận: ruột non, manh tràng và trực tràng. Mẫu tổ chức ngâm bảo quản trong formol 10% ựể làm tiêu bản vi thể.
h. Phương pháp làm tiêu bản vi thể ựược thực hiện theo quy trình tẩm ựúc bằng parafin, nhuộm Haematoxylin Ờ Eosin (HE).
- Cố ựịnh bệnh phẩm: Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% Tiến hành lần lượt các bước sau:
+ Rửa formol: Lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành các miếng có chiều dài, rộng khoảng 4-5mm cho vào khuôn ựúc bằng nhựạ đem rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24h ựể rửa sạch formol.
+ Sau ựó ựưa mẫu vào hệ thống máy chuyển ựúc mẫu tự ựộng trong 18h. lấy mẫu ra và tiến hành ựúc block.
+ đúc Block
đặt miếng bệnh phẩm nằm theo ý muốn vào chắnh giữa khuôn block ựổ nhanh parafin lỏng vào block.
đặt khuôn ựã ựúc sang bàn lạnh của máy làm nguội block. để nguội từ từ ựến khi ựông cứng và chắc là ựược.
Hệ thống máy chuyển ựúc mẫu tự ựộng gồm 12 bình ựược trình bày dưới bảng sau
Bình Hóa chất Thời gian
(giờ) Bình Hóa chất Thời gian (giờ) 1 Cồn 60ồC 1: 00 7 Cồn 100ồC 1: 30 2 Cồn 60ồC 1: 00 8 Cồn 100ồC 1: 30 3 Cồn 70ồC 1: 30 9 Xylen I 1: 30 4 Cồn 80ồC 1: 30 10 Xylen II 1: 30 5 Cồn 96ồC 1: 30 11 Parafin I 2: 00 6 Cồn 100ồC 1: 30 12 Parafin II 2: 00
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35
- Cắt dán mảnh gồm:
+ Cắt mảnh: Cắt bằng máy microton với ựộ mảnh cắt khoảng 3-5ộm , sao cho mảnh cắt không rách, nát phần tổ chức.
+ Tãi mảnh: Sau khi cắt ựược, dùng panh kẹp mảnh cắt ựặt vào nước lạnh sau ựó dùng phiến kắnh trong, sáng, không xước hớt mảnh cắt cho sang nước ấm 48oC rồi lấy kắnh vớt mảnh cắt sao cho vị trắ mảnh cắt ở 1/3 phiến kắnh. Sau ựó ựể tủ ấm 37oC ựến khi bệnh phẩm khô là ựược.
- Nhuộm tiêu bản gồm các bước:
+ Bước 1. Khử parafin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ:
Xylen I: 3 -5 phút Xylen II: 3 -5 phút Xylen III: 3 -5 phút + Bước 2. Khử Xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 100oC: 2 lần (mỗi lần 1 phút); Cồn 95oC: 1 lần; Cồn 70oC: 1 lần; Cồn 50oC: 1 lần
+ Bước 3. Khử cồn: Cho dưới vòi nước chảy 15 phút. + Bước 4. Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân)
Khi nhấc tiêu bản ra khỏi nước lau khô xung quanh tiêu bản, nhỏ Haematoxylin ngập tiêu bản. để trong khoảng hơn 5 phút sau ựó ựổ thuốc nhuộm ựi, rửa qua nước. đem lau sạch nước xung quanh tiêu bản và vẩy khô ựị Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản xanh tắm là ựược.
+ Bước 5. Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5-10 phút tùy theo thực tế màu Eosin. Sau ựó rửa nước chảy 15 phút cho hết eosin thừạ
+ Bước 6. Cho tiêu bản qua hai lọ cồn 100oC mỗi lọ 1 phút.
+ Bước 7. Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản ựi qua hai lọ xylen mỗi lọ 3 phút.
+ Bước 8. Gắn Baume canada
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản. Ấn nhẹ ựể dồn hết bọt khắ ra ngoàị
đánh giá kết quả bằng cách ựem soi tiêu bản nhuộm dưới kắnh hiển vi quang học vật kắnh 10 và 40. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tắm, bào tương bắt màu ựỏ tươi, tiêu bản trong sáng, không có nước, không có bọt khắ là ựược.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36
ị Phương pháp xác ựịnh các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu
Các chỉ tiêu về hệ hồng cầu gồm: Số lượng hồng cầu (triệu/ộl máu); Hàm lượng Hemoglobin (g/l); Tỷ khối huyết cầu (%); Nồng ựộ huyết sắc tố trung bình của hồng cầu (g/dl); Lượng huyết sắc tố trung bình của hồng cầu (ρg); Thể tắch trung bình của hồng cầu (fl) và diện tắch trung bình của hồng cầu (%CV), ựược xác ựịnh bằng máy Celldyn -3700.
Các chỉ tiêu về hệ bạch cầu: Số lượng bạch cầu (nghìn/ộl) và công thức bạch cầu (%) ựược xác ựịnh bằng máy Celldyn -3700
+ Thế của máu: Theo Schilling (1949)
+ Hướng nhân : Theo Schilling (1949)
Các chỉ tiêu sinh hóa máu: Protein tổng số (g/l); Lượng albumin (%); Hàm lượng các tiểu phần globulin (%).
Các chỉ tiêu này ựược phân tắch bằng máy máy phân tắch sinh hóa Awarenes Stat Faxx 3300 tại Công ty Medlatec.