b. Tiến hành thí nghiệm:
3.2.10 Thực hiện phản ứng PCR và định danh các dịng vi khuẩn triển vọng:
Sau khi tổng hợp kết quả các thí nghiệm trước, xét các tiêu chí về khả năng cố định đạm, hịa tan lân, sinh tổng hợp IAA và đặc biệt là khả năng kháng khuẩn. Ba
dịng vi khuẩn triển vọng Tr9, L4, R2 được lựa chọn để định danh nhận diện bằng kỹ
Mồi xuơi 27F: 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC-3’
Mồi ngược 1492R: 5’-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT-3’ Quy trình trích DNA :
Nuơi vi khuẩn trong 6ml mơi trường LB khoảng 14-16h. Chuyển 2ml dung dịch vi khuẩn vào tube 2,2ml.
Ly tâm 13000rpm/5’ (để phá vỡ màng tế bào vi khuẩn). Loại bỏ phần trong, lấy phần tủa.
Hịa tan cặn với 250ul dung dịch TE pH8 (Dung dịch đệm, giữ ADN ổn định
trong mơi trường, khơng bị biến tính).
Thêm 50µl dung dịch 10% SDS (Để phá hủy hồn tồn màng tế bào, loại bỏ polysaccharide và lipid) và 5µl Proteinase K (20mg/l) (Để làm phân hủy các protein giúp mẫu sạch hơn).
Ủ ở 65oC trong 20 phút (Xúc tác phản ứng), mỗi 5 phút đảo ngược tube một
lần để trộn đều dung dịch.
Thêm 400µl 10% CTAB/0.7M NaCl, trộn đều (Giúp giải phĩng ADN). Ủ ở
65oCtrong 20 phút.
Thêm 600µl Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) (Giúp kéo những phần khơng phải AND xuống phía dưới, AND ở trên và ở giữa cĩ tạo màng protein ngăn cách).
Trộn đều và ly tâm 12000 vịng/phút trong 10 phút.
Dùng pipet chuyển phần trong phía trên vào một tube mới và thêm 1ml
Isopropanol lắc đều (Nhằm làm tủa AND), giữ ở -20oC (giữ ADN khơng biến tính và
bảo vệ chúng khỏi các enzyme phân huỷ) ít nhất 30 phút (thời gian đủ để phản ứng xảy ra hồn tồn.
Ly tâm trong 10 phút ở 13000 vịng/phút.
Rửa với 1 ml ethanol 70% (Giúp rửa sạch các hố chất đã dùng trước đĩ hay tạp chất cịn lẫn), ly tâm 12000 vịng/phút trong 5 phút (lặp lại 2 lần).
Làm khơ ADN ở nhiệt độ phịng trong 1-2h hoặc sấy khơ bằng máy ly tâm chân khơng.
Sau khi tinh sạch DNA, tiến hành phản ứng PCR
Điện di sản phẩm trên agarose gel
Các sản phẩm sau khi được khuyết đại bằng phản ứng PCR, tiếp tục đem điện di trên agarose gel bằng bộ điện di.
Sau khi điện di, tiến hành quan sát các băng (band) DNA trên gel bằng hệ thống chụp hình gel để nhận diện các dịng vi khuẩn. Các band xuất hiện trên gel được quan sát và so sánh độ dài band DNA vi khuẩn phân lập với độ dài thang chuẩn.
Sau đĩ chụp hình gel chứa sản phẩm PCR các vi khuẩn đã phân lập dựa vào kết quả PCR xuất hiện band rỏ nét chọn ra các dịng vi khuẩn giải trình tự.
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN