2.9.1 Vi khuẩn Escherichia coli
Escherichia coli (E.coli) trước đây gọi là Bacterium coli commune hay Bacilus coli communis, lần đầu tiên phân lập từ phân trẻ em bị tiêu chảy năm 1885 và đặt tên theo bác sĩ nhi khoa Đức.
Vi khuẩn E.coli thuộc họ Enterobacteriaceas, vi khuẩn thường trực ở trong ruột,
chiếm tới 80% vi khuẩn hiếu khí vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực đường tiêu hĩa, vừa là vi khuẩn gây nhiều bệnh đường ruột và các cơ quan khác ( Lê Văn Tạo, 1997).
Vi khuẩn E.coli cĩ thể sinh trưởng ử nhiệt độ từ 5- 40oC, nhiệt độ thích hợp nhất
là 37oC, pH thích hợp nhất là 7,2 – 7,4 phát triển được pH từ 5,5 – 8. E.coli cĩ thể phát
triển trên mơi trường thơng dễ dàng, một số chủng cĩ thể phát triển trên mơi trường tổng hợp nên người ta chọ chúng để nghiên cứu về sinh vật học (Nguyễn Như Thanh, 1997).
Trong điều kiện bình thường vi khuẩn E.coli khu trú thường xuyên ở phần sau
của ruột, ít khi cĩ ở dạ dày hay đoạn đầu ruột non của động vật. Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát triển nhanh về số lượng, độc lực, gây loạn vi khuẩn bội nhiễm đường tiêu hĩa và trở thành nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978).
Vi khuẩn E.coli sản sinh nhiều loại độc tố: Enterotoxin, Verotoxin, Neurotoxin.
Mỗi loại độc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra.
Nhĩm độc tố đường ruột (Enterotoxin): gồm hai loại độc tố chịu nhiệt (gồm hai loại là STb cĩ vai trị quan trọng trong gây bệnh tiêu chảy do các chủng E.coli gây bệnh ở bê, nghé, dê, cừu, lợn con và trẻ sơ sinh) (Carter et al., 1995) và độc tố khơng chịu nhiệt LT ( LT là một trong những yếu tố gây triệu chứng tiêu chảy quan trọng) (Faibrother et al., 1992).
Nhĩm độc tố tế bào ( Shiga/ Verotoxin): nhĩm độc tố này được trong mơi trường
nuơi cấy tế bào Vero, được sản sinh bởi vi khuẩn E.coli gây bệnh tiêu chảy ở người,
Nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn E.coli cĩ khả năng kháng lại một số lạo kháng sinh như: Amoxicillin, Chloramphenicol, Trimethroprim, Tetracyclin, Streptomycin ( Đỗ Ngọc Thúy et al., 2002).
Để điều trị bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E.coli sử dụng phương pháp kháng sinh
đồ.
2.9.2 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila
Theo Lewis và Plumb (1979) cho rằng trong các chủng vi khuẩn thuộc giống
Aeromonas thì A. hydrophila được xem la chủng gây bệnh cho cá nước ngọt quan trọng nhất, gây bệnh nhiễm trùng máu, xuất huyết ở những lồi cá nuơi và cá tự nhiên,
theo Anhka (1990). A. hydrophila cũng gây bệnh lở loét cho cá tại Java-Indonesia và
gây tỉ lệ chết từ 80-90% .
Đỗ Thị Hịa et al (2004) bệnh nhiễm trùng do A. hydrophila thường gặp ở nhiều
loại thủy sản nước ngọt ở nhiều nước khác nhau như Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Thái Lan, Úc,.... Ở Việt Nam, các loại cá nuơi lồng, bè và ao hồ nước ngọt đều cĩ thể bị bệnh như: cá trắm cỏ, cá tra, cá basa, cá chép, cá trê....Tỷ lệ tử vong thủy sản thường từ 30-70%, bệnh xảy ra ở các giai đoạn khác nhau trong quá trinh sinh trưởng.
Bệnh do A. hydrophila ở nước ta cĩ thể xuất hiện quanh năm, nhưng thường tập trung
vào mùa xuân và mùa thu ở miền Bắc, ở miền Nam bệnh xuất hiện nhiều vào đầu màu
mưa, mùa cĩ nhiệt độ 25-28OC.
Ngồi việc gây bệnh cho thủy sản A. hydrophila cịn gây bệnh cho người, Nguyễn
Trung Cấp - Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung Ương cho biết từ năm 2009-2013 cĩ
hàng chục ca nhiễm A. hydrophila được ghi nhận, trong đĩ những trường hợp nhiễm
bệnh khi làm việc dưới nước bị đứt chân, tay. Cá biệt cĩ người bắt cá bị ngạnh cá đâm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
vào tay và nhiễm bệnh. Trrước đây cĩ một số bệnh nhân nhiễm A. hydrophila, bị hoại
tử da tay, chân nặng nề nhưng sau điều trị và được vá da, hiện bệnh nhân rất khỏe mạnh.
Cách phịng bệnh: tốt nhất là nên tránh lội vào vùng nước cĩ bùn, nước nhiễm bẩn khi cĩ vết xước ở tay chân mà khơng cĩ phương tiện bảo hộ. Người làm nghề đặc thù như làm việc trên bè cá tơm, bè tre nứa, cơng nhân vệ sinh...nên trang bị đủ phương tiện bảo hộ cá nhân. Khơng nên chơi đùa ở vũng nước cĩ bùn bẩn.
2.10 Tình hình nghiên cứu trong nước và thế giới 2.10.1 Tình hình nghiên cứu trong nước: 2.10.1 Tình hình nghiên cứu trong nước:
Tại Việt Nam, khá nhiều cơng trình nghiên cứu về tác dụng điều trị viêm gan của Diệp Hạ Châu đã được tiến hành, chẳng hạn: nhĩm nghiên cứu của Lê Võ Định Tường (Học Viện Quân Y - 1990 - 1996) đã thành cơng với chế phẩm Hepamarin từ Phyllanthus amarus; nhĩm nghiên cứu của Trần Danh Việt và Nguyễn Thượng Dong (Viện Dược Liệu) với bột Phyllanthin (2001).
Diệp Hạ Châu được dùng sớm nhất tại Viện Đơng y Hà Nội (1967) trong điều trị xơ gan cổ trướng.
Năm 1977, một nhĩm bác sĩ Việt Nam, khoa Tiêu hố, Gan, Mật đã sử dụng bài thuốc gia truyền của Trần Xuân Thiện gồm 3 vị là Diệp Hạ Châu đắng, Xuyên tâm liên, quả Dành dành để điều trị cho những người cĩ kết quả xét nghiệm HBsAg (+). Sau một thời gian điều trị, kết quả xét nghiệm âm tính được coi là khỏi. Tỷ lệ đạt
26/98 bệnh nhân..
Nghiên cứu của Ngơ Bá Duy et al. (2012) cho biết sử dụng cao Diệp Hạ Châu
đắn (30ml/con, 3 lần/ngày, trong 20 ngày) cho chĩ bệnh viêm gan thực nhiễm với CCI4 đã giúp 85% chĩ cĩ các chỉ tiêu sinh lý (AST, ALT, ALP, TB và DB) và hình ảnh siêu âm về bình thường sau 15 ngày điều trị.
2.10.2 Tình hình nghiên cứu thế giới:
Tác dụng giải độc gan và chữa viêm gan siêu vi B chỉ mới được các nhà khoa học lưu ý từ những năm 1980 về sau. Nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật Bản và Ấn Độ cho biết họ đã phân lập được những hợp chất trong cây Diệp Hạ Châu cĩ khả năng chữa bệnh viêm gan. Một báo cáo trên tạp chí Lancet vào năm 1988 cũng xác định tác dụng này. Theo đĩ, 2 nhà khoa học Blumberg và Thiogarajan đã điều trị 37 trường hợp viêm gan siêu vi B với kết quả 22 người âm tính sau 30 ngày dùng Diệp Hạ Châu. Đối với viêm gan siêu vi, 50% yếu tố lây truyền của virus viêm gan B trong máu đã mất sau 30 ngày sử dụng loại cây này (với liều 900 mg/ngày).
Một nghiên cứu của trường Đại học Dược Santa Catarina (Brazil-1984) đã phát hiện một alkaloid của Diệp Hạ Châu (phyllan thoside) cĩ tác dụng chống co thắt cơ vân và cơ trơn, các nhà khoa học đã nhờ vào điều này để giải thích hiệu quả điều trị sỏi thận, sỏi mật của cây thuốc.
Năm 1995, các nhà khoa học Brazil cũng phát hiện tác dụng giảm đau mạnh và bền vững của lồi cây này. Tác dụng này được cho là do acid gallic, cĩ ý nghĩa trong tình trạng viêm gan, tổn thương gan do bia rượu.
Theo dẫn liệu của Patela (2011), chất chiết cồn của P.amarus được chứng minh
là cĩ hoạt tính cao nhất chống lại Salmonella typhi.. Dịch chiết trong nước và trong
methanol của lá cây P. amarus ở nồng độ 100mg/ml được kiểm tra với E.coli,
Streptococcus spp, Klebsiella spp, Pseudomonas spp và Staphylococcus. Kết quả cho
thấy dịch chiết thơ ức chế E. coli, Streptococcus và S.aureus. Trong một nghiên cứu
khác, dịch chiết thân lá của Diệp Hạ Châu đắng cĩ đặc tính kháng khuẩn đối với
Bacillus cereus ATCC 11778, B. subtilis ATCCC 6633, Bacteroides fragilis ATTC
25285, E. faecalis ATCCC 29212, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC27853,
S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 12228 và Streptococcus pyogenes
ATCC 19615 với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) từ 0,25 đến 16mg/ml. Hoạt tính kháng khuẩn này là do phyllanthin.
Nhiều kết quả nghiên cứu chứng minh quan trọng cả về cơ bản và ứng dụng của chất Diệp Hạ Châu hoặc các hoạt chất với nhiều tác dụng như chống chứng lãng quên, chống ung thư, chống sốt rét, lợi tiểu, tránh thai hạ đường huyết và giảm cholesterol trong máu, điều hịa miễn dịch và bảo vệ thận ( Patel et al.,2011).
CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Phương tiện nghiên cứu 3.1.1 Địa điểm-thời gian: 3.1.1 Địa điểm-thời gian:
Địa điểm: Phịng thí nghiệm Vi sinh vật và phịng thí nghiệm Thực phẩm thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Cơng nghệ Sinh học.
Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 8/2013 -11/2013
3.1.2 Vật liệu: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu cây Diệp Hạ Châu ấp Tầm Vu và ấp Mỹ Yên, xã Trà Cơn, huyện Trà Ơn tỉnh Vĩnh Long.
Vi khuẩn E. coli được cung cấp từ phịng Sinh học phân tử, Viện Nghiên Cứu
và Phát Triển Cơng nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Vi khuẩn A. hydrophila
được cung cấp từ khoa Thủy Sản, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.3 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm:
Sử dụng máy mĩc và các thiết bị hiện cĩ tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Cơng nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Những thiết bị, dụng cụ để phân lập và khảo sát đặc tính của vi khuẩn:
− Đĩa Petri, ống nghiệm, ống đong.
− Tủ cấy vi sinh vậtBiosafe II – ESCO (Singapore)
− Tủ ủ vi sinh vật Binder (Đức).
− Kính hiển vi olympus CHT (Nhật)
− Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức).
− Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Đức).
− Tủ sấy EHRET (Đức).
− pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ).
− Cân điện tử Satorius (Đức).
− Đĩa petri, ống nghiệm.
− Máy ly tâm - Eppendorf.
− Bộ micropipette.
− Những thiết bị, dụng cụ cần thiết khác trong phịng thí nghiệm: tủ lạnh, máy
chụp ảnh kỹ thuật số Canon Digital Ixus 75 (Nhật), máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu.
3.1.4 Hĩa chất và mơi trường:
a. Hĩa chất dùng để khử trùng mẫu:
− Nước cất khử trùng.
− Ethanol (Cồn 70o).
− H2O2 (3%).
b. Hĩa chất dùng để phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn:
• Mơi trường nuơi cấy PDA:
Bảng 1: Thành phần hĩa chất mơi trường PDA
Tên hĩa chất Liều lượng (g/l)
Dịch trích khoai tây 1 lít (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Destro 20
Agar 20
pH 5,6 + 0,2
Mơi trường PDA bán rắn chỉ sử dụng 2% agar mơi trường đặc. * Cách nấu dịch trích khoai tây:
− Nấu khoai tây và nước cất theo tỉ lệ trên khoảng 15 phút, bỏ xác và để nguội, lọc qua giấy lọc để loại bỏ xác khoai tây cịn lại trong dịch trích.
Mơi trường sau khi được khử trùng nhiệt ướt rĩt vào đĩa petri giữ trong tủ ủ. Tất cả các thao tác đều thực hiện trong tủ cấy vơ trùng.
Chú ý: mơi trường dùng để cấy trải vi khuẩn được bổ sung kháng sinh với liều lượng 1ml/l mơi trường. Mơi trường cấy chuyển thì khơng cần bổ sung thêm kháng sinh.
• Hĩa chất nhuộm Gram vi khuẩn:
− Nước cất khử trùng.
− Iod.
− Fushin.
− Crystal violet.
− Ethanol (Cồn 70o).
• Hĩa chất dùng để đo lượng NH4+ tổng hợp bằng phương pháp Indolphenol
blue (Page et al., 1982)
− Chuẩn bị dung dịch KCl 2 M: Hịa tan 15 g KCl vào trong 100 ml nước cất.
− Stock (NH4 +): Hịa tan 0,4717 g (NH4)2SO4 vào 1 lít nước. Trữ dung dịch trong tủ lạnh.
− Thuốc thử phenol nitroprusside: hịa tan 5 g phenol và 0,025 g nitroprusside
trong 0,5 lít nước cất.
− Hypochloride buffer: hịa tan 15 ml NaOCl + 5 g NaOH vào 0,5 lít nước cất.
− Chuẩn bị các dịng vi khuẩn đã tách rịng và nuơi tăng sinh mơi trường NFb
Bảng 2: Thành phần hĩa chất mơi trường NFb lỏng
Hĩa chất Liều lượng (g/l)
Malic aciad 5 MgSO4,7H2O 0,2 CaCl2 0,02 NaCl 0,02 KOH 4,5 FeEDTA (1,64%) 4 ml/l Vi lượng (0,2g Na2MoO4,2H2O, 0,235g MnSO4,H2O, 0,28 g H3BO3, 0,008g CuSO4,5H2O, 0,24g ZnSO4,7H2O) 2 ml/l
Vitamin (0,001g biotin, 0,002 pyridoxine) 1 ml/l
Bromothymol blue 0,5% trong 0,2N 2 ml/l
pH 6,8
Nguồn: Kirchhof et al., (1997).
• Hĩa chất dùng để đo lượng IAA tổng hợp bằng phương pháp Salkowski:
− Chuẩn bị thuốc thử Salkowski R2: 4,5g FeCl3 trong 1l H2SO4 10,8M (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
− Chuẩn bị phosphat buffer 200 ml:
+ A: KH2PO4 0,136 g/100 ml nước cất.
+ B: K2HPO4 0,174 g/100 ml nước cất.
+ Lấy 39ml A + 61ml B cho thêm nước cất vừa đủ 200ml ta được dung dịch
C, chỉnh pH = 7.
• Hĩa chất dùng để kiểm tra khả năng phát triển của vi khuẩn nội sinh trên mơi
Bảng 3: Thành phần hĩa chất mơi trường NBRIP
Hĩa chất Liều lượng (g/l)
Sucrose 10 MgSO4,7H2O 0,25 Ca3PO4 5 MgCl2,6H2O 5 KCl 0,2 (NH4)2SO4 0,1
Bromothymol blye 0,5% trong KOH 0,2N 6 ml/l
Agar Mơi trường đặc: 20
Mơi trường bán đặc: 2
pH 7,0
* Nguồn: Nautiyal,(1999)
• Hĩa chất dùng để khảo sát khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh bằng
phương pháp giấy thấm (d=0,6cm).
Sử dụng mơi trường LB để khảo sát khả năng khả năng khángr vi khuẩn E.coli
và Aeromonas hydrophila.
Bảng 4: Thành phần mơi trường LB
Tên hĩa chất Liều lượng (g/l)
Tryptone 10
NaCl 10
Yeast extract 5
Agar 20
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phương pháp thu thập và xử lý mẫu:
Thu mẫu Diệp Hạ Châu ở nhiều điểm khác nhau và ít sử dụng phân bĩn hoặc khơng cĩ bĩn phân ở tỉnh Vĩnh Long, mỗi điểm lấy 4-5 cây, chọn cây đang ở giai đoạn
tăng trưởng mạnh. Thời gian thu mẫu là buổi sáng và chiều, lấy tồn bộ cây rửa dưới vịi nước cho sạch đất, tiếp tục rửa lại bằng nước cất vơ trùng. Sau đĩ, cắt rời rễ, thân, lá và trái thành từng đoạn nhỏ khoảng 2cm, cho mẫu vào cốc nhỏ lần lượt khử trùng theo quy trình sau:
− Rửa mẫu cồn 70o trong 30 giây.
− Rửa mẫu H2O2 trong 3-5 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
− Rửa lại với nước cất 4 lần.
− Chuyển mẫu vào tủ cấy.
Khi thu mẫu chúng ta lấy phần đất xung quanh gốc cây khoảng 4-5cm để hạn chế rễ cây bị đứt và xác định pH của đất.
3.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn:
Để kiểm tra vi sinh vật cịn sĩt lại trên bề mặt rễ, thân, lá và trái sau khi khử trùng chuyển nước rửa lần thứ 4 chủng lên mơi trường PDA để xem cĩ vi khuẩn xuất hiện hay khơng. Nếu cĩ vi khuẩn xuất hiện, mẫu cần được khử trùng triệt để hơn để loại bỏ các vi khuẩn cĩ trong đất.
Sau khi xử lý mẫu ta thực hiện phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây Diệp Hạ Châu theo quy trình sau:
− Mẫu được giã nhuyễn trong cối đã được khử trùng trước đĩ, bổ sung thêm
1ml nước cất đã khử trùng. Hút phần dịch trích mẫu cho vào tube 1,5ml. Trộn đều dịch trích mẫu bằng máy khuấy, hút 500µl dịch trích mẫu lần lượt cho vào các ống nghiệm
cĩ chứa mơi trường NFb bán đặc đã khử trùng nhiệt ướt 121o C. Ủ mẫu ở 30oC trong 2
đến 4 ngày.
− Sau 2 đến 4 ngày, quan sát các ống nghiệm xuất hiện một lớp màng mỏng
(vịng pellice), cách mặt mơi trường khoảng 0,5 cm, đĩ là dấu hiệu chứng tỏ cĩ sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh.
− Dùng micropipet hút cẩn thận 5µl từ vịng pellice nhỏ lên mơi trường PDA
đặc đã được khử trùng trước đĩ, dùng que cấy trải mẫu đều trên bề mặt mơi trường, hơ
dưới ngọn đền cồn cho đến khi khơ bề mặt mơi trường, ủ 30oC.
− Khi khuẩn lạc vi khuẩn phát triển xuất hiện trên bề mặt mơi trường, tiếp tục
giống nhau. Kiểm tra độ rịng của vi khuẩn bằng cách quan sát dưới kính hiển vi bằng phương pháp giọt ép ở vật kính X40 (độ phĩng đại 400 lần) thực hiện như sau:
+ Nhỏ 1 giọt nước cất (khoảng 20 µl) đã được khử trùng lên kính mang vật
(lame).
+ Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn đến khi nĩng đỏ và để nguội.
+ Dùng đầu kim cấy lấy một ít mẫu đã được cấy trữ trong ống nghiệm chấm vào
giọt nước cất trên kính mang vật và tán đều (trong điều kiện vơ trùng).
+ Dùng kính đậy vật (lammelella) đậy lên giọt nước cất bằng cách để một cạnh
của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật một gĩc 45o hạ kính đậy vật xuống từ từ
sao cho khơng cĩ bọt khí trong mẫu vật. Nếu quan sát thấy mẫu vi khuẩn đã rịng (giống nhau về hình dạng) thì cấy chuyển sang ống nghiệm chứa mơi trường đặc tương
ứng để trữ ở 4oC và được xem như là một dịng.
3.2.3 Nhuộm Gram vi khuẩn: a. Mục đích: a. Mục đích:
Nhuộm Gram dùng để nhận diện các tế bào vi sinh vật sơ hạch trước khi sử dụng