Điều trị
Điều trị bệnh do E. coli cần phải đạt đƣợc mục tiêu là cắt đứt E. coli gây bệnh, khắc phục các ảnh hƣởng xấu và tạo điều kiện môi trƣờng tốt. Trị liệu nhanh và hiệu quả nếu có thể. Kết hợp giữa việc tiêu diệt mầm bệnh E. coli với việc bổ sung nƣớc và dung dịch điện giải để chống mất nƣớc, nâng cao sức đề kháng của con vật trong khi sử dụng kháng sinh và hóa dƣợc tiêu diệt mầm bệnh (Fairbrother, 1992).
Theo nghiên cứu của Võ Thành Thìn và ctv. (2011), thì kháng sinh còn nhạy với vi khuẩn E. coli là ceftazidime, norfloxacin, gentamycin.
Dùng các loại vitamin để nâng cao thể trạng và sức đề kháng của cơ thể. Để chống mất nƣớc và chất điện giải cần cho uống dung dịch glucose hoặc pha dung dịch electroline vào nƣớc uống cho heo uống tự do.
Ngày nay, có thể dùng kháng thể chống E. coli chế tạo qua lòng đỏ trứng gà để điều trị, cho hiệu quả tốt, không có tồn dƣ kháng sinh, không gây còi cọc heo sau điều trị (Lê Văn Tạo, 2006).
Phòng bệnh
Quy trình phòng ngừa cảm nhiễm vi khuẩn E. coli phải đạt đƣợc mục tiêu giảm thiểu số lƣợng vi khuẩn E. coli gây bệnh trong môi trƣờng xung quanh bằng biện pháp vệ sinh tiêu độc tốt, duy trì điều kiện môi trƣờng chăn nuôi thích hợp, đồng thời tạo mức độ miễn dịch cao cho heo con (Fairbrother, 1992).
Sử dụng kháng thể men vi sinh sản xuất từ các chủng vi sinh vật có lợi nhƣ
Lactobacillus acidopphilus, B. subtilis, B. licheniformis, B. polymysa...để điều trị ứng dụng rộng rãi trong chăn nuôi.
28
Theo Đào Trọng Đạt và ctv. (1999), thì một trong những yếu tố quan trọng nhất để phòng bệnh tiêu chảy ở heo con do E. coli là duy trì cho heo con sống ở môi trƣờng thích hợp (32 – 340C đối với heo chƣa cai sữa và 28 – 300
C cho heo vừa cai sữa). Không để chuồng bị mƣa tạt, gió lùa, vì heo con rất dễ bị mất nhiệt do bề mặt da quá rộng so với thể trọng.
Các hộ chăn nuôi cần phải có chuồng nuôi heo cai sữa, heo cai sữa đƣợc phân chia cùng ngày hoặc gần ngày cai sữa nhất. Tập cho heo con ăn sớm nhằm kích thích hệ thống tiêu hóa của heo phát triển hoàn thiện về chức năng và tổ chức nhằm thích nghi với điều kiện sống. Cẩn trọng chăm sóc và cho khẩu phần ăn thích hợp cho heo con mới cai sữa để tránh tiêu chảy.
Khẩu phần có thể giảm xuống để hạn chế sự cƣ trú của E. coli trong ruột, thêm acid lactic vào khẩu phần ăn hoặc nƣớc uống có thể làm giảm độ pH dạ dày và ức chế sự tăng nhanh số lƣợng của vi khuẩn E. coli gây bệnh.
29
CHƢƠNG 3
PHƢƠNG TIỆN PHƢƠNG PHÁP 3.1 Thời gian, địa điểm và đối tƣợng nghiên cứu
3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian thực hiện: đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 8/2013 đến tháng 11/2013. Địa điểm: phòng thí nghiệm vệ sinh thực phẩm, Bộ môn Thú Y, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng – Trƣờng Đại học Cần Thơ.
3.1.2 Đối tƣợng thí nghiệm
Heo con bị tiêu chảy tại các hộ chăn nuôi của huyện Vũng Liêm, Long Hồ và thành phố Vĩnh Long. Mẫu phân heo tiêu chảy chƣa qua điều trị.
3.2 Phƣơng tiện nghiên cứu
3.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm
Thùng lấy mẫu, tăm bông, bình cồn, hột quẹt, ống nghiệm lấy mẫu, giấy đo PH, bông gòn, phiếu điều tra, kéo, tủ sấy, tủ ấm, autoclave, máy li tâm, máy lắc, máy chạy điện di, máy PCR, bếp đun cách thủy, buồng cấy vô trùng, cân, dao, kéo, đĩa petri, ống nghiệm, ống đong, ống hút, chai, que cấy, đèn cồn, nhiệt kế, túi nylon, găng tay, khẩu trang, đá khô.
3.2.2 Hóa chất, môi trƣờng
Cồn, nƣớc cất, natri clorua, MacConkey Agar (MC; Merck, Germany), Nutrient Agar (NA), Kligler Iron Agar (KIA; BBLTM, France), Trypticase Soy Agar (TSA; BBL, USA), Lysine Indole Motility Medium (LIM; Eiken, Japan), VP medium (Eiken, Japan).
Thuốc thử Kowacs, VP1, VP2.
Kháng thể chuẩn K88, K99, 987P đƣợc cung cấp bởi Denka Seiken Co., Ltd. Tokyo Japan.
Các hóa chất và dung dịch dùng cho phản ứng PCR: TE buffer, TAE buffer, agrarose, Distilled – Water, Master Mix 2X (Promega Corperation, Madison, USA), Ethidium bromide, 100 bp DNA Ladder (Fermentas, USA).
Các đoạn mồi sử dụng trong phản ứng PCR để khuếch đại các gene độc tố LT, STa, STb (Promega Corporation, USA).
30
3.3 Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm 3.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 3.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu
Nghiên cứu này đƣợc khảo sát và tiến hành lấy mẫu tại huyện Vũng Liêm, Long Hồ và thành phố Vĩnh Long với số lƣợng mẫu nhƣ sau: trên đàn heo bị tiêu chảy nghi ngờ do vi khuẩn E. coli, lấy từ 1 – 2 mẫu phân heo đặc trƣng, đại diện cho đàn và lấy mẫu từ nhiều đàn để đại diện cho trại hoặc nông hộ. Tùy theo quy mô của trại, nông hộ.
Trƣớc khi tiến hành lấy mẫu chúng tôi quan sát tình hình thực tế ở trại, nông hộ: vệ sinh chuồng trại, sát trùng, tình trạng sức khỏe của đàn heo sau đó tiến hành thu thập thông tin của nông hộ về số lƣợng heo, thức ăn, cách xử lí nguồn nƣớc, tiêm phòng… sau đó điền thông tin vào phiều điều tra (xem Phụ Lục 1).
Mẫu được thu thập như sau: dùng bông gòn lau sạch hậu môn heo con bị tiêu chảy. Dùng kẹp đƣa giấy pH vào hậu môn để đo. Dùng tăm bông ngoáy vào trực tràng của heo con bị tiêu chảy. Đƣa mẫu tăm bông có phân của heo con tiêu chảy vào ống nghiệm vô trùng có chứa môi trƣờng chuyên chở Carry- blair. Bảo quản ở điều kiện lạnh và đƣa về phòng thí nghiệm để phân lập.
3.3.2 Phƣơng pháp phân lập, định danh vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy trên heo con trên heo con
Trên môi trƣờng MC vi khuẩn E. coli hình thành khuẩn lạc to, tròn đều, màu hồng nhạt, mặt khuẩn lac hơi lồi, kích thƣớc 2 -3 mm.
Tiến hành: mẫu phân từ que tăm bông đƣợc ria cấy trên môi trƣờng MC, đem ủ ở 370C trong 24h. Làm thuần khuẩn lạc bằng cách chọn 8 – 10 khuẩn lạc điển hình, ria cấy trên đĩa thạch MC, đem ủ ở 370C trong 24 giờ, sau đó khuẩn lạc đƣợc cấy sang môi trƣờng TSA để kiểm tra sinh hóa, giữ giống và định chủng. Qui trình phân lập đƣợc thể hiện qua sơ đồ sau:
31 370C/24h Định chủng Mẫu phân MC K88 K99 987P
ETEC tiêu chảy ở heo con TSA
TSA
TSA
Cấy thuần trên MC
Thử các chỉ tiêu sinh hóa
E. coli
Giữ giống Ly trích DNA 370C/24h 370C/24h
370C/24h
Hình 3.1: Qui trình nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn ETEC
32
Bảng 3.1: Các phản ứng sinh hóa định danh vi khuẩn E. coli
Đặc tính sinh hóa KIA Indole M R VP Citrat e Glucose Lactose H2S Gas
E. coli Enterobacter Citrobacter Klebsiella + + + +h + + + +h - - - - + + + + + - - - + - + - - + - + - + + +
VP:Voges-Proskauer KIA:Kigler Iron Agar MR: Methyl Red (+h): men có sinh hơi
Vi khuẩn E. coli lên men sinh hơi glucose, galactose, mantose, arabinose, xylose, manitol, fructose. Có thể lên men hoặc không lên men đƣờng saccharrose, rafinose, xalixin, esculin, dunxit, glycerol.
Vi khuẩn E. coli đƣợc định danh bằng phản ứng sinh hóa qua các môi trƣờng: KIA: là môi trƣờng Kilgler Iron Agar lấy vi khuẩn từ môi trƣờng TSA cấy vào ống nghiệm chứa thạch nghiêng KIA, ủ ấm ở 370C trong 24 giờ.
Kết quả: E. coli lên men đƣờng lactose, glucose và có sinh hơi.
Phản ứng kiểm tra tính sinh Indole: dùng que cấy, cấy một lƣợng nhỏ vi khuẩn từ môi trƣờng TSA vào ống nghiệm chứa môi trƣờng peptone, ử ấm ở 370
C trong 24 giờ. Nhỏ vào môi trƣờng nuôi cấy vài giọt thuốc thử Kowacs. Kết quả là E. coli cho phản ứng dƣơng tính, trên bề mặt xuất hiện một lớp màu đỏ. Phản ứng Methyl Red (MR) và Voges - Proskauer (VP): dùng que cấy, cấy một lƣợng nhỏ sinh khối vi khuẩn từ môi trƣờng TSA vào ống nghiệm chứa MR – VP ủ ấm ở 370C trong 24 giờ. Thêm vài giọt thuốc thử Methyl Red, E. coli cho phản ứng dƣơng tính, môi trƣờng có màu đỏ. Với phản ứng VP, nhỏ vào môi trƣờng nuôi cấy vài giọt thuốc thử VP1, sau đó nhỏ vài giọt VP2 để yên vài phút, E. coli cho phản ứng âm tính, bề mặt môi trƣờng không màu. Phản ứng Citrate: lấy vi khuẩn từ môi trƣờng TSA cấy vào ống nghiệm chứa thạch nghiêng Simmon‟s citrate, ủ ấm ở 370C trong 24 giờ. E. coli cho phản ứng âm tính, môi trƣờng không đổi màu.
3.3.3 Phƣơng pháp định danh các chủng vi khuẩn E. coli bằng phản ứng huyết thanh học huyết thanh học
Sau khi đã kiểm tra sinh hóa xác định đƣợc vi khuẩn E. coli, tiến hành định chủng bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với các kháng thể chuẩn K88, K99, 987P (Moon và ctv., 1977).
33
Tiến hành: xác định chủng K88: trên phiến kính sạch cho một giọt nƣớc muối sinh lí và một giọt kháng thể chuẩn chủng E. coli K88, trộn mỗi giọt trên với mỗi vòng que cấy đầy vi khuẩn của mẫu kiểm tra. Lắc trộn nhẹ nhàng và đọc kết quả sau 30 giây đến 15 phút. Mẫu dƣơng tính chỉ ngƣng kết ở giọt kháng thể mà không ngƣng kết với giọt nƣớc muối sinh lí.
Xác định chủng E. coli K99, 987P: quy trình tƣơng tự nhƣ xác định chủng K88.
Phản ứng định danh đƣợc thể hiện qua sơ đồ sau:
3.3.4 Xác định độc tố của vi khuẩn ETEC gây tiêu chảy trên heo con bằng phƣơng pháp PCR phƣơng pháp PCR
Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phƣơng pháp invitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại
Hình 3.2: Định danh chủng vi khuẩn E. coli bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính
Kháng thể chuẩn K88, K99, 987P Phản ứng dƣơng tính (có ngƣng kết) Phản ứng âm tính (không có ngƣng kết) Vi khuẩn E. coli Đối chứng âm E. coli K88, K99, 987P
34
nhân số lƣợng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ vào hoạt động của enzyme polymerase và các cặp mồi (primer) đặc hiệu cho DNA này. Hiện nay kĩ thuật này đƣợc sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo các gene, chuẩn đoán bệnh, phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm…
Trong chuẩn đoán xác định độc tố ruột vi khuẩn ETEC hiện nay thì phƣơng pháp PCR đƣợc đánh giá là phƣơng pháp có độ nhạy cao, cho kết quả nhanh và phù hợp. PCR gồm nhiều chu kì nối tiếp nhau. Mỗi chu kì gồm 3 bƣớc (Trần Linh Thƣớc, 2010):
Bước 1 (biến tính – denaturation): trong một dung dịch phản ứng gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA thƣờng đƣợc biến tính ở nhiệt độ cao, thƣờng là 94 – 950C. Mạch đôi DNA tách ra thành dạng mạch đơn.
Bước 2 (bắt cặp – anealation): trong bƣớc này nhiệt độ đƣợc hạ thấp cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động từ 40 – 700
C.
Bước 3 (tổng hợp – elongation): nhiệt độ đƣợc tăng lên đến 720C giúp cho enzyme polymerase (vốn là polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt nhất, thời gian của bƣớc này phụ thuộc vào trình tự DNA cần khuếch đại, thƣờng kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
Xác định các độc tố đƣờng ruột của vi khuẩn E. coli bằng phản ứng PCR nhƣ mô tả của Lee et al., (2008).
Chiết tách DNA mẫu (DNA template)
Mẫu DNA của vi khuẩn E. coli đƣợc chiết tách bằng phƣơng pháp sốc nhiệt.
Chuẩn bị: khuẩn lạc của vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng NA sau 24 giờ, nƣớc cất tinh khiết không chứa DNA, RNA.
Cách thực hiện:
Dùng pipette hút 1ml nƣớc cất tinh khiết cho vào ống eppendorf.
Dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên môi trƣờng NA (lấy đầy que cấy) cho vào ống eppendorf trên.
Trộn đều bằng máy vortex. Đun sôi ở 1000C trong 10 phút. Ly tâm 15.000 vòng/15 phút.
Thu hoạch phần dịch nổi bên trên có chứa DNA của tế bào vi khuẩn, bảo quản ở -200
35
Đoạn mồi dùng trong phản ứng PCR
Trình tự nucleotide các cặp mồi dùng để xác định độc tố của vi khuẩn E. coli
dựa theo Kim et al., (2010).
Bảng 3.2: Trình tự nucleotide và kích thƣớc các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR xác định các yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli (Kim et al.,
2010) Gene mục tiêu Trình tự nucleotide (5’ – 3’) Kích thƣớt sản phẩm (bp) LT ATTTACGGCGTTACTATCCTC TTTTGGTCTCGGTCAGATATG 281 STa GCTAATGTTGGCAATTTTTATTTCTGTA AGGATTACAACAAAGTTCACAGCAGTAA 190 STb GCCTATGCATCTACACAATA TGAGAAATCGACAATGTCCG 279
Hỗn hợp nhiên liệu trong phản ứng
Phản ứng PCR phát hiện gene qui định một số yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli đƣợc thực hiện với tổng thể thể tích 25 µl với các hóa chất do Promega (USA) sản xuất và cung cấp.
Bảng 3.3: Hỗn hợp master mix của phản ứng PCR xác định một số yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy trên heo con (Promega Corporation, USA)
STT Thành phần Số lƣợng
1 Nƣớc tinh khiết không chứa DNA, RNA 9,5 µl
2 Master Mix 2X 12,5 µl
3 Mồi xuôi 0,5 µl
4 Mồi ngƣợc 0,5 µl
5 DNA mẫu 2 µl
Tổng 25 µl
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
36
Bảng 3.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR xác định các yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli (Kim et al., 2010)
Gene mục tiêu Chu trình nhiệt Tiền biến tính (0C/phút) Biến tính (0C/phút) Gắn mồi (0C/phút) Kéo dài (0C/phút) Kết thúc (0C/phút) Lặp lại chu kì 30 lần LT STa STb 94/10 94/10 94/10 94/1 52/10 72/1:30 94/1 55/10 72/1:30 94/1 51/10 72/1:30 72/10 72/10 72/10 Phương pháp điện di sản phẩm PCR
Sau khi thực hiện phản ứng PCR, sản phẩm đƣợc điện di trên thạch agarose 1,5%, dung môi điện di là TAE 1X buffer. Hút 10 µl DNA ladder cho vào giếng thứ nhất của gel agarose, giếng thứ 2 và giếng thứ 3 lần lƣợt cho 10 µl đối chứng dƣơng và đối chứng âm, kể từ giếng thứ 4 trở đi cho vào 10 µl sản phẩm PCR. Sau đó đặt gel vào buồng điện di và chạy ở hiệu điện thế 50V trong thời gian 1 giờ.
Nhuộm bản gel agarose trong Ethidium bromide
Sau khi kết thúc quá trình điện di, cho gel agarose vào dung dịch Ethidium bromide, trong thời gian 30 phút.
Đọc kết quả và chụp ảnh
Sau khi nhuộm bản gel trong Ethidium bromide xong, gel đƣợc đƣa vào buồng đọc kết quả dƣới đèn tia UV và chụp ảnh.
Kích thƣớc các đoạn gel sau khi khuếch đại đƣợc xác định dựa vào thang DNA chuẩn 100bp.
3.3.5 Các chỉ tiêu theo dõi
Khảo sát điều kiện tự nhiên và tình hình chăn nuôi của huyện Vũng Liêm, Long Hồ và thành phố Vĩnh Long.
Tỷ lệ tiêu chảy trên heo con tại huyện Vũng Liêm, Long Hồ và thành phố Vĩnh Long.
37
Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E. coli trên heo con theo địa điểm. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E. coli trên phân heo con theo lứa tuổi.
Tỷ lệ định danh các chủng vi khuẩn E. coli K88, K99, 987P trên heo con theo địa điểm
Tỷ lệ định danh các chủng vi khuẩn E. coli K88, K99, 987P trên heo con theo mẹ và sau cai sữa.
Kết quả xác định độc tố của vi khuẩn ETEC gây tiêu chảy trên heo con.
3.4 Phƣơng pháp xử lí số liệu
Số liệu đƣợc xử lí thống kê theo Phƣơng pháp Chi – square bằng phần mềm Minitab 16.0, Chi square Yates và Fixer Exactly Test bằng phần mềm Excel 2010.
38
CHƢƠNG 4
KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 Khảo sát điều kiện tự nhiên và tình hình chăn nuôi tại huyện Vũng Liêm, Long Hồ và thành phố Vĩnh Long Liêm, Long Hồ và thành phố Vĩnh Long
Vị trí địa lí
Vĩnh Long là tỉnh nằm ở trung tâm châu thổ đồng bằng Sông Cửu Long, thuộc vùng giữa sông tiền và sông hậu, cách Thành phố Hồ Chí Minh 136 km với tọa độ địa lý từ 90 52‟ 45‟‟ đến 100 19‟ 50‟‟ vĩ độ bắc đến 1040 41‟ 25‟‟ đến 1060 17‟ 00‟‟. Phía Bắc và Đông Bắc giáp tỉnh Tiền Giang và Bến Tre, phía Đông Nam giáp tỉnh Trà Vinh, phía tây giáp tỉnh Hậu Giang và thành phố Cần