2.4.5.1 Độc tố tế bào: loại độc tố này phá hủy tế bào, tăng tính thẩm thấu thành mạch, tạo bệnh tích ở các tổ chức cơ quan và gây thẩm dịch mô bào. Theo Konowalchuck và ctv. (1977), đã phát hiện một loại độc tố hoạt động trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào Vero (nên chúng đƣợc đặt tên là độc tố tế bào Vero), đƣợc sản sinh bởi vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy ở ngƣời, tiêu chảy và bệnh phù đầu ở heo con. Ảnh hƣởng gây bệnh ở tế bào của độc tố Vero rất khác so với ảnh hƣởng của độc tố đƣờng ruột không chịu nhiệt cổ điển ở nhóm vi khuẩn E. coli gây bệnh đƣờng ruột (ETEC). Độc tố Vero (VTs) hay Shiga (SLTs) là thuật ngữ đƣợc sử dụng trƣớc đây. Gần đây, các nhà khoa học đã đề nghị sử dụng tên độc tố Shiga (Stx) cho tất cả những độc tố tế bào này. Stx sản sinh bởi E. coli bao gồm 2 nhóm: Stx1và Stx2. Độc tố Shiga ở heo là một loại trong nhóm độc tố Stx2 với một số khác biệt trong đặc tính sinh học. Stx1và Stx2 gây độc cho tế bào Hela. Stx2e kém độc hơn, nhƣng gây độc mạnh cho tế bào Vero.
2.4.5.2 Độc tố thần kinh: đây là loại độc tố phá hủy tế bào thần kinh, gây những triệu chứng thần kinh (Lê Văn Tạo, 2006).
2.4.5.3 Độc tố đƣờng ruột: Khả năng sản sinh độc tố đƣờng ruột là một trong những yếu tố độc lực quan trọng của vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy ở heo con. Độc tố đƣờng ruột làm thay đổi nƣớc, chất điện giải ở ruột non và dẫn tới tiêu chảy (Gyles and Fairbrother, 2010).
18
Bảng 2.2: Sự tƣơng quan giữa kháng nguyên và khả năng sinh độc tố của vi khuẩn E. coli (Gaastra and De Graaf, 1982)
Kháng nguyên Loại độc tố ST LT LT + ST K88 + + + 987P + - - K99 + - - F41 + - -
Độc tố đƣờng ruột của vi khuẩn Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC)
Có 2 loại độc tố đƣờng ruột của vi khuẩn thuộc nhóm ETEC đƣợc xác định là độc tố không chịu nhiệt (LT) và độc tố chịu nhiệt (ST) (Nataro and Kaper, 1998).
Bảng 2.3: Một số đặc tính của hai loại độc tố của vi khuẩn E. coli (Carter and Wise Darla, 2004)
Độc tố bền với nhiệt độ (Heat – Stable Enterotoxin)
Độc tố không bền với nhiệt độ (Heat – Labile Enterotoxin)
Bò cái Có hiện diện Ít hiện diện
Heo Có hiện diện Có hiện diện
Khả năng chịu nhiệt Chịu đƣợc 1210
C trong 15 phút
Bị phá hủy ở 600
C trong 30 phút
Hoạt hóa Andenyl cyslase Không Có Hoạt hóa Guanylase
cyslase
Có Không
Tác động lên chuột thí nghiệm
19
Độc tố không chịu nhiệt (LT)
LT là độc tố nhạy cảm với nhiệt có cấu trúc và cơ chế gây độc gần giống với cholera enterotoxin (CT) đƣợc sản xuất từ Vibrio cholerae, gene mã hóa cho cấu trúc của độc tố LT nằm trên plasmid có nguồn gốc từ vi khuẩn Vibrio cholerae (Nataro and Kaper, 1998). Cấu trúc của độc tố LT gồm 1 tiểu đơn vị A (A-subunit) với 240 axít amin và 5 tiểu đơn vị B (B-subunit) với 103 acid amin (O‟Bien and Holmes, 1996). Tiểu đơn vị A mang hoạt tính enzyme của độc tố và gồm 2 chuỗi peptide A1, peptide A2. Hai chuỗi peptide này liên kết nhau bởi cầu nối disulfide giữa A1- acid amin Cystein (Cys) 187 và A2- Cys199. Chuỗi A2 tạo thành cái móc liên kết không đồng hóa trị giữa tiểu đơn vị A và lỗ hổng giữa của vòng 5 tiểu đơn vị. Năm tiểu phân tử B trong cấu trúc của LT sắp xếp thành vòng nhẫn 5 cạnh bền vững. Mỗi tiểu phân tử B có 1 vị trí gắn với thụ thể tiếp nhận độc tố của tế bào vật chủ (O‟Bien and Holmes, 1996).
LT đƣợc chia làm 2 nhóm: LT có hai nhóm chính là LT-I và LT-II, hai độc tố này không đáp ứng miễn dịch chéo với nhau. LT-I đƣợc biểu hiện trong các chủng E. coli gây bệnh trên ngƣời và động vật còn LT-II chỉ đƣợc tìm thấy trên những chủng E. coli phân lập đƣợc trên động vật và một số rất ít chủng phân lập đƣợc trên ngƣời tuy nhiên không có bằng chứng cho thấy LT-II có khả năng gây bệnh do đó cơ chế tác động của độc tố LT tập trung chủ yếu vào LT-I, LT thấy ở trên heo là LT-I . LT-II có 55 – 57% tƣơng đồng với LT-I ở tiểu đơn vị A, nhƣng không cho thấy sự tƣơng đồng ở tiểu đơn vị B, LT-II có hai kiểu kháng nguyên khác nhau là LT-IIa và LT-IIb, hai kiểu kháng nguyên này có sự tƣơng đồng với nhau là 71% ở tiểu đơn vị A và 66% ở tiểu đơn vị B. LT-II có cơ chế tác động tƣơng tự LT-I là gia tăng hàm lƣợng cAMP nội bào, khác biệt là receptor của LT-II là GD1 còn của LT-I là GM1, tuy nhiên nhƣ đề cập ở trên thì không có bằng chứng cho thấy LT-II gây độc cho tế bào của ngƣời và động vật (Nataro and Kaper, 1998). Những loại độc tố LTs đƣợc sản sinh trên ngƣời và heo do ETEC đƣợc ký hiệu là LTs và LTp dựa trên sự khác nhau các gen mã hóa của độc tố (Fairbrother, 1992).
Cơ chế tác động của độc tố LT
Sau khi bám lên các thụ thể tiếp nhận của tế bào biểu mô ruột, độc tố LT đƣợc chuyển qua màng và đi vào nội bào. Bên trong tế bào, độc tố di chuyển nhờ hệ thống vận chuyển của Golgi. Sau khi tiểu phân tử A và B phân cắt ở Golgi, tiểu phân tử A đƣợc chuyển đến màng lƣới nội chất, tiểu phân tử B đƣợc tái sử dụng từ Golgi cho đến cuối endosome và lysosome (Rappuoli et al.,1999). Độc tố LT trong tế bào là enzyme adenylate cyclase nằm ở lớp màng ngoài của tế bào biểu mô ruột (Nataro and Kaper, 1998). Do đó, sau khi chuyển đến
20
bào tƣơng, chuỗi peptide A1 bám lên phức hợp protein Gsαβγ. Chuỗi peptide A1 có hoạt tính nhƣ enzyme ADP-ribosyltransferase chuyển phần ADP- ribosyl từ NAD đến protein của liên kết GTP (GTP-binding protein) là Gsα. Quá trình bám của GTP lên Gsα làm cho Gsα tách khỏi phức hợp protein Gsβγ và gây hoạt hóa enzyme Adenylate cyclase, làm gia tăng cAMP (cyclic adenosine monophosphate) trong tế bào. Vì vậy, cAMP sẽ hoạt hóa enzyme cAMP-dependent protein kinase (A kinase) dẫn đến sự phosphoryl hóa kênh ion chloride (Cl-) ở màng tế bào biểu mô vƣợt quá mức bình thƣờng. Kết quả là kích thích tế bào bên dƣới tiết Cl- và ngăn cản sự hấp thụ NaCl bởi những tế bào lông nhung. Hàm lƣợng ion Cl- trong lòng ruột gia tăng kéo theo sự di chuyển thụ động của nƣớc từ tế bào vào lòng ruột gây tiêu chảy, bên cạnh đó còn có các cơ chế khác liên quan đến hệ thống thần kinh ruột (ENS) và sự đáp ứng miễn dịch của tế bào thành ruột với độc tố cho nên có ít nhất một cơ chế tác động đồng thời với cơ chế tăng hàm lƣợng cAMP (Nataro and Kaper, 1998).
Độc tố chịu nhiệt (ST)
ST là protein nhỏ chỉ đƣợc cấu tạp từ một đơn vị, nhƣng cấu trúc chứa nhiều amino acid cystein, do đó trong cấu trúc protein chứa nhiều cầu nối disulfic tính chất này dẫn đến khả năng kháng nhiệt của độc tố. Độc tố này có 2 loại, có cấu trúc và cơ chế hoạt động khác biệt nhau đó là STa và STb, gene mã hóa cho hai độc tố này đƣợc qui định trên plasmid, một số gene đƣợc phát hiện nằm trên transposon.
Độc tố STa
Cấu tạo: STa có trọng lƣợng phân tử là 2 kDa, có hai dạng khác nhau là STap trong cấu trúc chứa 18 amino acid có khả năng gây độc cho heo và ngƣời, dạng còn lại là STah cấu tạo từ 19 amino acid chỉ gây độc cho ngƣời. Ban đầu STa đƣợc tổng hợp dƣới dạng pre-protoxin chứa 72 amino acid, sau đó đƣợc phân cắt thành peptide có 52 acid amine, dạng peptide này đƣợc chuyển vào vùng periplasm sau đó hình thành cầu nối disulfic nhờ enzyme DsbA đƣợc mã hóa trên genome của vi khuẩn, sau đó dạng protoxin sẽ đƣợc cắt thành dạng toxin hoàn chỉnh và đƣợc khuếch tán qua vách tế bào. Trong đó, có 6 acid amin cystein tạo thành 3 cầu nối disulfide bên trong cấu trúc phân tử của STa là Cys6 - Cys11, Cys7 - Cys15 và Cys10 - Cys18. Ngoài ETEC ra thì STa còn đƣợc tổng hợp bởi một vài chủng vi khuẩn gram (-) khác nhƣ Yersinia enterocolitica và V. cholerae non-O1, bên cạnh đó STa có 50% protein tƣơng đồng với độc tố EAST1 ST của EAEC. Sự khác nhau giữa 2 biến thể chỉ xuất hiện ở đầu tận cùng N- với 4-5 acid amin (Nataro and Kaper, 1998).
21
Cơ chế tác động của độc tố STa: receptor của STa là enzyme xuyên màng đƣợc gọi là guanylate cyclase C (GC-C), GC-C nằm trên phần đầu màng của tế bào biểu mô ruột, protein này là receptor của hormone guanylin của thú, hocmone này có 15 amino acid trong đó có 4 cystein đóng vai trò giúp cân bằng trạng thái bình thƣờng của ruột, cơ chế tác động của receptor này với guanylin dựa vào cơ chế ligand-receptor, đó là cơ chế receptor gắn với ligand tiếp nhận các thông tin ngoại bào từ đó thúc đẩy sự hoạt động của các enzyme nội bào. Tƣơng tự nhƣ vậy sau khi liên kết với receptor, STa thúc đẩy hoạt tính guanylate cyclase của enzyme này làm gia tăng hàm lƣợng cGMP nội bào, cGMP hoạt hóa protein kinase G, hoạt động của enzyme này làm tăng hoạt động của kênh clorua, làm đẩy mạnh việc tiết ion clorua và ức chế sự hấp thu NaCl dẫn đến dịch ruột bị tiết ra ngoài gây nên hiện tƣợng tiêu chảy. Độc tố STa tác động nhanh hơn LT do không cần phải di chuyển vào bên trong tế bào mà truyền tín hiệu trực tiếp vào bên trong. Ngoài GC-C ra thì STa có thể còn có các receptor khác tuy nhiên GC-C là receptor chiếm ƣu thế nhất (Nataro and Kaper, 1998). Độc tố STa kích thích giải phóng cGMP đạt nồng đa sau 5 phút. Tuy nhiên, quá trình này duy trì trong thời gian ngắn (Hitotsubashi et al .,1992).
Độc tố STb
Cấu tạo: tƣơng tự độc tố STa, độc tố STb cũng là chuỗi polypeptide đƣợc sản sinh chủ yếu bởi các chủng vi khuẩn ETEC phân lập từ heo, STb ban đầu cũng đƣợc tổng hợp dƣới dạng pretoxin có 72 acid amine sau đó đƣợc chế biến thành dạng protein hoàn chỉnh có 48 acid amine, protein này có trọng lƣợng phân tử là 5,1 kDa, cấu trúc của STb không tƣơng đồng với STa mặc dù trong cấu tạo của nó cũng có 4 amino acid cystein (Nataro and Kaper, 1998). Trong cấu trúc của STb, 4 acide amine cystein tạo thành 2 cầu nối disulfide giữa Cys10 – Cys48 và Cys21 – Cys36. Các cầu nối này có vai trò giúp cho STb bền vững trong chu chất (Fujii et al .,1991).
Cơ chế tác động của độc tố STb: STb làm tổn thƣơng các tế bào ruột do tác động lên các lông ruột dẫn đến các lông tơ trên tế bào biểu mô bị mất hoặc bị thu ngắn lại, receptor của STb vẫn chƣa đƣợc xác định, có thể độc tố này gắn vào những vùng không chuyên biệt trên màng tế bào trƣớc khi đƣa vào trong, tác động của STb trong tế bào không giống nhƣ STa thay vì phân tiết clorua, độc tố này dẫn đến việc phân tiết bicarbonate, STb không làm gia tăng hàm lƣợng cAMP hay cGMP nội bào mà tác động của nó làm tăng hàm lƣợng calcium nội bào bằng cách hấp thu từ bên ngoài, ngoài ra tác động của nó còn làm tăng sự phân tiết PGE2 và serotonin, cho thấy tác động của STb có liên quan đến hệ thống thần kinh ruột (ENS) (Nataro and Kaper, 1998).
22
Hơn nữa, sự gia tăng nồng độ Ca2+
trong tế bào cũng có thể kích thích mở kênh Cl-, tăng cƣờng tiết Cl-
và HCO-3 vào lòng ruột (Worrell và ctv.,1991). Kết quả cuối cùng là sự tích lũy chất lỏng trong lòng ruột và gây tiêu chảy.