2.5.1 Điều kiện xuất hiện bệnh
Các chủng vi khuẩn E. coli thuộc nhóm ETEC tham gia vào quá trình gây bệnh có 2 đặc tính chủ yếu: khả năng bám dính vào các tế bào biểu mô ruột nhờ các yếu tố bám dính ở bề mặt vi khuẩn nhƣ F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P) và khả năng sản sinh một hoặc nhiều loại độc tố đƣờng ruột, bao gồm độc tố chịu nhiệt và không chịu nhiệt (Fairbrother, 1992).
E. coli là vi khuẩn môi trƣờng, nơi nào cũng có. Bình thƣờng, vi khuẩn không gây tác hại trên ký chủ (103 CFU/g phân). Khi mật số tăng lên cao (106 – 109 CFU/g phân) thì nó sẽ trở nên gây bệnh.
Các chủng E. coli K88, K99, 987P là vi khuẩn khu trú và hoạt động trong đƣờng ruột của heo và có thể trở thành nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy trên heo khi đề kháng của heo giảm súc. Chỉ có các chủng E. coli mang các yếu tố độc lực mới gây tiêu chảy. Vì thế trong điều kiện vệ sinh kém hoặc chuồng đẻ thâm canh liên tục, hình thành nên nhóm E. coli gây bệnh trong môi trƣờng sẽ dẫn đến sự bộc phát tiêu chảy cho heo (Fairbrother, 1992).
Heo sau cai sữa rất mẫn cảm với các chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy do tại thời điểm này lƣợng kháng thể thụ động không còn đủ bảo hộ. Hơn nữa, số lƣợng các thụ thể của kháng nguyên bám dính F4 trên lớp tế bào niêm mạc ruột tăng dần theo lứa tuổi của heo cho đến giai đoạn sau cai sữa. Đây là điều kiện thuận lợi để vi khuẩn bám dính và gây bệnh (Nagy et al.,1992). Ở heo sau cai sữa, hệ tiêu hóa chƣa hoàn chỉnh, nếu cho ăn quá nhiều thức ăn không đƣợc tiêu hóa kịp sẽ tích tụ trong đƣờng ruột tạo chất nền cho vi khuẩn
E. coli phát triển. Do đó ở giai đoạn này heo rất dễ nhiễm bệnh. Stress và việc thay đổi khẩu phần thức ăn đột ngột cũng là yếu tố quan trọng làm cho bệnh tiêu chảy gia tăng.
Nhiệt độ chuồng cũng quan trọng. Nhiệt độ thấp hơn 250C, nhu động ruột giảm, việc bài thải vi khuẩn và tiếp nhận kháng thể bị đình trệ làm tăng số lƣợng E. coli gây bệnh trong ống tiêu hóa của những heo con này làm cho heo bị tiêu chảy trầm trọng hơn những heo con khác đƣợc giữ ở nhiệt độ 300C (Sarmiento, 1983).
Stress do tách mẹ hay do chuyển chuồng có thể gây ức chế sợi phó giao cảm, làm giảm nhu động ruột, giảm tiết dịch tiêu hóa, tạo điều kiện cho vi khuẩn có hại ở đƣờng ruột phát triển (Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997).
24
2.5.2 Cơ chế gây bệnh tiêu chảy
Theo Sarmiento (1983) vi khuẩn E. coli bằng cách trực tiếp hay gián tiếp xâm nhập vào đƣờng ruột của heo. Trong ruột, khi có đủ các điều kiện thuận lợi, vi khuẩn nhân lên với số lƣợng lớn, sản sinh yếu tố kháng khuẩn Colicin (ColV). Yếu tố này tiêu diệt hoặc hạn chế sự phát triển của các vi khuẩn đƣờng ruột khác, đặc biệt là các vi khuẩn có lợi, các vi khuẩn lactic và trở thành vi khuẩn có số lƣợng lớn trong ruột. Khi có số lƣợng lớn, chiếm ƣu thế, vi khuẩn tràn lên ruột non, nhờ kháng nguyên bám dính, vi khuẩn bám vào lớp tế bào biểu mô nhung mao ruột và xâm nhập vào bên trong lớp tế bào biểu mô. Trong lớp tế bào biểu mô, vi khuẩn phát triển nhân lên làm phá huỷ lớp tế bào này gây viêm ruột. Cũng tại đây, vi khuẩn sản sinh độc tố đƣờng ruột (cơ chế gây tiêu chảy độc tố LT, STa, STb xem phần 2.4.4). Nƣớc tập trung ở ruột làm cho ruột căng lên, cộng với khí do vi khuẩn E. coli trong ruột lên men tạo ra làm cho ruột căng lên, sức căng của ruột và quá trình viêm ruột kích thích hệ thần kinh thực vật ở ruột tạo nên những cơn nhu động ruột mạnh đẩy nƣớc và phân ra ngoài gây tiêu chảy.
2.5.3 Triệu chứng và bệnh tích
Triệu chứng
Tiêu chảy do vi khuẩn E. coli phụ thuộc vào yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli và tuổi cũng nhƣ tình trạng miễn dịch của heo con. Có trƣờng hợp bệnh diễn ra nhanh và chết trƣớc khi có triệu chứng tiêu chảy (Fairbrother, 1992). Bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E. coli xảy ra đối với heo theo mẹ và sau cai sữa, thƣờng xảy ra ở heo con vừa cai sữa. Mức độ tiêu chảy tùy thuộc vào độc lực của vi khuẩn và độ tuổi của heo. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn ở heo sau cai sữa cũng rất cao nhƣng do heo dễ chăm sóc nên heo có thể qua khỏi, tỷ lệ heo mắc bệnh chết giảm. Heo nhiễm bệnh có thể xuất hiện riêng lẽ từng cá thể hoặc cả đàn. Heo tiêu chảy phân màu vàng hoặc hơi nâu, tiêu chảy thƣờng xuất hiện 3-5 ngày ở heo cai sữa và có thể kéo dài hàng tuần. Heo có biểu hiện còi cọc, chậm lớn, lông xù, da nhăn nheo, mắt trũng sâu. Trong trƣờng hợp tiêu chảy nặng, trọng lƣợng cơ thể có thể giảm 30- 40%. Hệ thống cơ vùng xoang bụng nhão và mất trƣơng lực. Tỷ lệ heo mắc bệnh chết có thể đến 70% (Gyles and Fairbrother, 2010).
Bệnh tích
Bệnh tích đại thể có thể thấy đƣợc là heo con bị mất nƣớc nặng. Bệnh tích đặc trƣng ở heo sau cai sữa là các tĩnh mạch trên đƣờng cong lớn dạ dày bị nhồi huyết, ruột non giãn nở, thành ruột non xuất huyết. Một số trƣờng hợp thấy
25
xuất huyết thành dạ dày, chất chứa trong ruột có màu nâu (Gyles and Fairbrother, 2010).
Bệnh tích vi thể đƣờng tiêu hóa tùy thuộc vào độc lực của chủng vi khuẩn gây bệnh. Heo nhiễm các chủng ETEC thƣờng có biểu hiện xuất huyết tĩnh mạch màng treo ruột, thỉnh thoảng có xuất huyết trong lòng ruột, bạch cầu trung tính và đại thực bào tăng trong hạch màng treo ruột và chuyển vào trong lòng ruột. Hệ thống lông nhung có thể bị bong tróc và hoại tử hoặc tập trung thành từng đám. Khi quan sát tiêu bản màng nhầy ruột non dƣới kính hiển vi điện tử thấy vi khuẩn gắn chặt với các tế bào biểu mô ruột và cạnh các vi lông nhung. Trong trƣờng hợp bệnh nặng, các lông nhung biến mất và xuất hiện các sợi tơ huyết làm tắt các vi tĩnh mạch ở màng treo ruột, dạ dày, ruột non và kết tràng (Gyles and Fairbrother, 2010).
2.5.4 Chẩn đoán và chẩn đoán phân biệt Chẩn đoán Chẩn đoán
Tiêu chảy do E. coli ở heo theo mẹ và sau cai sữa thƣờng kết hợp với các tác nhân gây bệnh khác nên phải chú ý phân biệt khi chẩn đoán. Chẩn đoán tiêu chảy do E. coli có thể dựa trên triệu chứng lâm sàng, bệnh tích, phân lập vi khuẩn hoặc ứng dụng các phƣơng pháp chẩn đoán phân tử với các yếu tố độc lực đã đƣợc xác định.
Chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng
Có thể chẩn đoán phân biệt dựa vào độ pH của phân. Dịch tiêu chảy ETEC gây ra thƣờng có độ pH kiềm, trong khi đó nếu bệnh tiêu chảy do hấp thu kém hay do virus gây ra thì phân có độ pH acid (Fairbrother, 1992).
Chẩn đoán bệnh đƣờng ruột do E. coli có thể dựa vào biểu hiện lâm sàng, bệnh tích tế bào và sự hiện diện của vi khuẩn gram âm luôn bám dính vào màng nhày ruột non (Wilson and Francis, 1986).
Heo tiêu chảy có thể xuất hiện riêng lẽ từng cá thể hoặc cả đàn. Heo có biểu hiện lờ đờ, chậm chạp, da nhăn nheo, ẩm ƣớt, mắt trũng sâu. Phân tiêu chảy thƣờng có màu trắng hay vàng nhạt và dính bết ở vùng hậu môn, hai chân sau. Đôi khi heo tiêu chảy có lẫn máu, một số heo có thể bị sốt, nôn. Heo sau cai sữa thƣờng còi cọc, giảm trọng lƣợng cơ thể do mất nƣớc.
Chẩn đoán dựa vào bệnh tích
Có thể dựa vào các bệnh tích điển hình nhƣ dạ dày bị giãn nở chứa nhiều thức ăn không tiêu, ruột non giãn nở, thành ruột non xuất huyết, hệ thống lông nhung có thể bị bong tróc và hoại tử hoặc tập trung thành từng đám.
26
Dựa vào cấu trúc bề mặt của không tràng và hồi tràng, nếu có sự bám chắc của vi khuẩn và tiếp xúc một cách bình thƣờng trên các sợi vi nhung mao thì do ETEC gây ra. Nếu sợi vi nhung mao bất thƣờng và bất dƣỡng thì nguyên nhân có thể do virus và cầu trùng gây nên (Alexander, 1994).
Chẩn đoán có tính thuyết phục là khi phân lập đƣợc E. coli đến nhóm huyết thanh. Ngoài ra, chứng minh E. coli bám dính vào màng nhày ruột non bằng cách cắt lạnh tiêu bản và phát hiện bằng phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp hoặc cố định mẫu trong dung dịch formol, đúc khối bằng parafin và xét nghiệm bằng kỹ thuật miễn dịch men peroxidase (Fairbrother, 1992).
Chẩn đoán bằng phương pháp phân lập vi khuẩn
Cần thiết phải phân lập vi khuẩn từ phân, bệnh phẩm là máu, hạch ruột, lớp niêm mạc ruột non và chất chứa trong ruột heo. Thử độc lực, kiểm tra yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli phân lập đƣợc để khẳng định vai trò gây bệnh của chúng. Nếu phân lập đƣợc một lƣợng lớn E. coli, cần xác định xem chúng có phải là loại gây bệnh hay không. Có nhiều phản ứng huyết thanh học để định danh vi khuẩn E. coli. Phản ứng ngƣng kết đơn giản trên phiến kính cũng phát hiện hầu hết các trƣờng hợp có bệnh (Đào Trọng Đạt và ctv., 1999).
Chẩn đoán phân biệt
Bệnh do ETEC gây tiêu chảy ở heo con, heo sau cai sữa cần phân biệt với những nguyên nhân gây tiêu chảy với những heo con cùng lứa tuổi. Những nguyên nhân đó bao gồm: Adenovirus, Rotavirus, Isopora suis, Clostridium perfringens, TGE virus, PEDV type II.
Chẩn đoán phân biệt với bệnh tiêu chảy do Clostridium perfringens type C: thƣờng gây bệnh trên heo con dƣới 10 ngày tuổi, phân tiêu chảy thƣờng có máu. Heo con trở nên yếu và suy nhƣợc, thuốc kháng sinh không có tác dụng trong trƣờng hợp này và heo con thƣờng chết sớm. Ở heo 2 tuần tuổi thì bệnh nhẹ hơn và phân có màu vàng sậm. Khi mổ khám thấy vách tế bào không tràng đỏ thẫm hoặc đỏ tía và chất chứa trong ruột có màu nhƣ rƣợu vang (Alaxander, 1994).
Nếu tiêu chảy do Rotavirus gây nên (thƣờng ở heo con trên 7 ngày tuổi) thì heo con bị suy nhƣợc hoặc bỏ ăn 1 hoặc 2 ngày. Phân lỏng và vàng, tỷ lệ chết thấp và thƣờng thay đổi sau 5 ngày. Trong trƣờng hợp này thuốc kháng sinh không có tác dụng. Dạ dày heo con thƣờng chứa những hạt sữa và dịch ruột non giống nhƣ kem (Alexander, 1994).
Tiêu chảy do virus TGE và PED type II thì thƣờng tạo thành dịch và lan truyền nhanh chóng và nó gây bệnh trên tất cả các lứa tuổi. Phân thƣờng lỏng
27
nhƣ nƣớc, màu sắc rõ nét và mùi đặc trƣng. Heo tiêu chảy thƣờng dừng lại sau 4 – 5 ngày bệnh và thƣờng phục hồi sức lực sau 7 ngày. Tỷ lệ chết do virus PED type II thì thƣờng thấp hơn. Mổ khám thấy vách dạ dày, ruột mỏng và có màu sáng đục, trong ống ruột thƣờng sinh hơi và chất dịch có màu nhạt. Các sợi vi nhung mao bị bất dƣỡng và biến dạng (Alexander, 1994).
Tiêu chảy do cầu trùng Isospora suis gây nên thì phân mềm nhão, chất dịch lỏng, màu nâu vàng. Heo con ốm yếu, lông xù và một số ít có thể tự khỏi bệnh sau vài tuần bệnh hoặc sau cai sữa. Mổ khám thấy thành không tràng và hồi tràng có điểm dày lên, chất chứa dạng kem hoặc lỏng hơn. Sợi vi nhung mao ruột bị bất dƣỡng và có điểm xuất huyết (Alexander, 1994).
2.5.5 Điều trị và phòng bệnh Điều trị Điều trị
Điều trị bệnh do E. coli cần phải đạt đƣợc mục tiêu là cắt đứt E. coli gây bệnh, khắc phục các ảnh hƣởng xấu và tạo điều kiện môi trƣờng tốt. Trị liệu nhanh và hiệu quả nếu có thể. Kết hợp giữa việc tiêu diệt mầm bệnh E. coli với việc bổ sung nƣớc và dung dịch điện giải để chống mất nƣớc, nâng cao sức đề kháng của con vật trong khi sử dụng kháng sinh và hóa dƣợc tiêu diệt mầm bệnh (Fairbrother, 1992).
Theo nghiên cứu của Võ Thành Thìn và ctv. (2011), thì kháng sinh còn nhạy với vi khuẩn E. coli là ceftazidime, norfloxacin, gentamycin.
Dùng các loại vitamin để nâng cao thể trạng và sức đề kháng của cơ thể. Để chống mất nƣớc và chất điện giải cần cho uống dung dịch glucose hoặc pha dung dịch electroline vào nƣớc uống cho heo uống tự do.
Ngày nay, có thể dùng kháng thể chống E. coli chế tạo qua lòng đỏ trứng gà để điều trị, cho hiệu quả tốt, không có tồn dƣ kháng sinh, không gây còi cọc heo sau điều trị (Lê Văn Tạo, 2006).
Phòng bệnh
Quy trình phòng ngừa cảm nhiễm vi khuẩn E. coli phải đạt đƣợc mục tiêu giảm thiểu số lƣợng vi khuẩn E. coli gây bệnh trong môi trƣờng xung quanh bằng biện pháp vệ sinh tiêu độc tốt, duy trì điều kiện môi trƣờng chăn nuôi thích hợp, đồng thời tạo mức độ miễn dịch cao cho heo con (Fairbrother, 1992).
Sử dụng kháng thể men vi sinh sản xuất từ các chủng vi sinh vật có lợi nhƣ
Lactobacillus acidopphilus, B. subtilis, B. licheniformis, B. polymysa...để điều trị ứng dụng rộng rãi trong chăn nuôi.
28
Theo Đào Trọng Đạt và ctv. (1999), thì một trong những yếu tố quan trọng nhất để phòng bệnh tiêu chảy ở heo con do E. coli là duy trì cho heo con sống ở môi trƣờng thích hợp (32 – 340C đối với heo chƣa cai sữa và 28 – 300
C cho heo vừa cai sữa). Không để chuồng bị mƣa tạt, gió lùa, vì heo con rất dễ bị mất nhiệt do bề mặt da quá rộng so với thể trọng.
Các hộ chăn nuôi cần phải có chuồng nuôi heo cai sữa, heo cai sữa đƣợc phân chia cùng ngày hoặc gần ngày cai sữa nhất. Tập cho heo con ăn sớm nhằm kích thích hệ thống tiêu hóa của heo phát triển hoàn thiện về chức năng và tổ chức nhằm thích nghi với điều kiện sống. Cẩn trọng chăm sóc và cho khẩu phần ăn thích hợp cho heo con mới cai sữa để tránh tiêu chảy.
Khẩu phần có thể giảm xuống để hạn chế sự cƣ trú của E. coli trong ruột, thêm acid lactic vào khẩu phần ăn hoặc nƣớc uống có thể làm giảm độ pH dạ dày và ức chế sự tăng nhanh số lƣợng của vi khuẩn E. coli gây bệnh.
29
CHƢƠNG 3
PHƢƠNG TIỆN PHƢƠNG PHÁP 3.1 Thời gian, địa điểm và đối tƣợng nghiên cứu
3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian thực hiện: đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 8/2013 đến tháng 11/2013. Địa điểm: phòng thí nghiệm vệ sinh thực phẩm, Bộ môn Thú Y, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng – Trƣờng Đại học Cần Thơ.
3.1.2 Đối tƣợng thí nghiệm
Heo con bị tiêu chảy tại các hộ chăn nuôi của huyện Vũng Liêm, Long Hồ và thành phố Vĩnh Long. Mẫu phân heo tiêu chảy chƣa qua điều trị.
3.2 Phƣơng tiện nghiên cứu
3.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm
Thùng lấy mẫu, tăm bông, bình cồn, hột quẹt, ống nghiệm lấy mẫu, giấy đo PH, bông gòn, phiếu điều tra, kéo, tủ sấy, tủ ấm, autoclave, máy li tâm, máy lắc, máy chạy điện di, máy PCR, bếp đun cách thủy, buồng cấy vô trùng, cân, dao, kéo, đĩa petri, ống nghiệm, ống đong, ống hút, chai, que cấy, đèn cồn, nhiệt kế, túi nylon, găng tay, khẩu trang, đá khô.
3.2.2 Hóa chất, môi trƣờng
Cồn, nƣớc cất, natri clorua, MacConkey Agar (MC; Merck, Germany), Nutrient Agar (NA), Kligler Iron Agar (KIA; BBLTM, France), Trypticase Soy Agar (TSA; BBL, USA), Lysine Indole Motility Medium (LIM; Eiken, Japan), VP medium (Eiken, Japan).
Thuốc thử Kowacs, VP1, VP2.
Kháng thể chuẩn K88, K99, 987P đƣợc cung cấp bởi Denka Seiken Co., Ltd. Tokyo Japan.
Các hóa chất và dung dịch dùng cho phản ứng PCR: TE buffer, TAE buffer, agrarose, Distilled – Water, Master Mix 2X (Promega Corperation, Madison, USA), Ethidium bromide, 100 bp DNA Ladder (Fermentas, USA).
Các đoạn mồi sử dụng trong phản ứng PCR để khuếch đại các gene độc tố LT, STa, STb (Promega Corporation, USA).
30
3.3 Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm 3.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 3.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu
Nghiên cứu này đƣợc khảo sát và tiến hành lấy mẫu tại huyện Vũng Liêm, Long Hồ và thành phố Vĩnh Long với số lƣợng mẫu nhƣ sau: trên đàn heo bị tiêu chảy nghi ngờ do vi khuẩn E. coli, lấy từ 1 – 2 mẫu phân heo đặc trƣng, đại diện cho đàn và lấy mẫu từ nhiều đàn để đại diện cho trại hoặc nông hộ.