3.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu
Nghiên cứu này đƣợc khảo sát và tiến hành lấy mẫu tại huyện Vũng Liêm, Long Hồ và thành phố Vĩnh Long với số lƣợng mẫu nhƣ sau: trên đàn heo bị tiêu chảy nghi ngờ do vi khuẩn E. coli, lấy từ 1 – 2 mẫu phân heo đặc trƣng, đại diện cho đàn và lấy mẫu từ nhiều đàn để đại diện cho trại hoặc nông hộ. Tùy theo quy mô của trại, nông hộ.
Trƣớc khi tiến hành lấy mẫu chúng tôi quan sát tình hình thực tế ở trại, nông hộ: vệ sinh chuồng trại, sát trùng, tình trạng sức khỏe của đàn heo sau đó tiến hành thu thập thông tin của nông hộ về số lƣợng heo, thức ăn, cách xử lí nguồn nƣớc, tiêm phòng… sau đó điền thông tin vào phiều điều tra (xem Phụ Lục 1).
Mẫu được thu thập như sau: dùng bông gòn lau sạch hậu môn heo con bị tiêu chảy. Dùng kẹp đƣa giấy pH vào hậu môn để đo. Dùng tăm bông ngoáy vào trực tràng của heo con bị tiêu chảy. Đƣa mẫu tăm bông có phân của heo con tiêu chảy vào ống nghiệm vô trùng có chứa môi trƣờng chuyên chở Carry- blair. Bảo quản ở điều kiện lạnh và đƣa về phòng thí nghiệm để phân lập.
3.3.2 Phƣơng pháp phân lập, định danh vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy trên heo con trên heo con
Trên môi trƣờng MC vi khuẩn E. coli hình thành khuẩn lạc to, tròn đều, màu hồng nhạt, mặt khuẩn lac hơi lồi, kích thƣớc 2 -3 mm.
Tiến hành: mẫu phân từ que tăm bông đƣợc ria cấy trên môi trƣờng MC, đem ủ ở 370C trong 24h. Làm thuần khuẩn lạc bằng cách chọn 8 – 10 khuẩn lạc điển hình, ria cấy trên đĩa thạch MC, đem ủ ở 370C trong 24 giờ, sau đó khuẩn lạc đƣợc cấy sang môi trƣờng TSA để kiểm tra sinh hóa, giữ giống và định chủng. Qui trình phân lập đƣợc thể hiện qua sơ đồ sau:
31 370C/24h Định chủng Mẫu phân MC K88 K99 987P
ETEC tiêu chảy ở heo con TSA
TSA
TSA
Cấy thuần trên MC
Thử các chỉ tiêu sinh hóa
E. coli
Giữ giống Ly trích DNA 370C/24h 370C/24h
370C/24h
Hình 3.1: Qui trình nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn ETEC
32
Bảng 3.1: Các phản ứng sinh hóa định danh vi khuẩn E. coli
Đặc tính sinh hóa KIA Indole M R VP Citrat e Glucose Lactose H2S Gas
E. coli Enterobacter Citrobacter Klebsiella + + + +h + + + +h - - - - + + + + + - - - + - + - - + - + - + + +
VP:Voges-Proskauer KIA:Kigler Iron Agar MR: Methyl Red (+h): men có sinh hơi
Vi khuẩn E. coli lên men sinh hơi glucose, galactose, mantose, arabinose, xylose, manitol, fructose. Có thể lên men hoặc không lên men đƣờng saccharrose, rafinose, xalixin, esculin, dunxit, glycerol.
Vi khuẩn E. coli đƣợc định danh bằng phản ứng sinh hóa qua các môi trƣờng: KIA: là môi trƣờng Kilgler Iron Agar lấy vi khuẩn từ môi trƣờng TSA cấy vào ống nghiệm chứa thạch nghiêng KIA, ủ ấm ở 370C trong 24 giờ.
Kết quả: E. coli lên men đƣờng lactose, glucose và có sinh hơi.
Phản ứng kiểm tra tính sinh Indole: dùng que cấy, cấy một lƣợng nhỏ vi khuẩn từ môi trƣờng TSA vào ống nghiệm chứa môi trƣờng peptone, ử ấm ở 370
C trong 24 giờ. Nhỏ vào môi trƣờng nuôi cấy vài giọt thuốc thử Kowacs. Kết quả là E. coli cho phản ứng dƣơng tính, trên bề mặt xuất hiện một lớp màu đỏ. Phản ứng Methyl Red (MR) và Voges - Proskauer (VP): dùng que cấy, cấy một lƣợng nhỏ sinh khối vi khuẩn từ môi trƣờng TSA vào ống nghiệm chứa MR – VP ủ ấm ở 370C trong 24 giờ. Thêm vài giọt thuốc thử Methyl Red, E. coli cho phản ứng dƣơng tính, môi trƣờng có màu đỏ. Với phản ứng VP, nhỏ vào môi trƣờng nuôi cấy vài giọt thuốc thử VP1, sau đó nhỏ vài giọt VP2 để yên vài phút, E. coli cho phản ứng âm tính, bề mặt môi trƣờng không màu. Phản ứng Citrate: lấy vi khuẩn từ môi trƣờng TSA cấy vào ống nghiệm chứa thạch nghiêng Simmon‟s citrate, ủ ấm ở 370C trong 24 giờ. E. coli cho phản ứng âm tính, môi trƣờng không đổi màu.
3.3.3 Phƣơng pháp định danh các chủng vi khuẩn E. coli bằng phản ứng huyết thanh học huyết thanh học
Sau khi đã kiểm tra sinh hóa xác định đƣợc vi khuẩn E. coli, tiến hành định chủng bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với các kháng thể chuẩn K88, K99, 987P (Moon và ctv., 1977).
33
Tiến hành: xác định chủng K88: trên phiến kính sạch cho một giọt nƣớc muối sinh lí và một giọt kháng thể chuẩn chủng E. coli K88, trộn mỗi giọt trên với mỗi vòng que cấy đầy vi khuẩn của mẫu kiểm tra. Lắc trộn nhẹ nhàng và đọc kết quả sau 30 giây đến 15 phút. Mẫu dƣơng tính chỉ ngƣng kết ở giọt kháng thể mà không ngƣng kết với giọt nƣớc muối sinh lí.
Xác định chủng E. coli K99, 987P: quy trình tƣơng tự nhƣ xác định chủng K88.
Phản ứng định danh đƣợc thể hiện qua sơ đồ sau:
3.3.4 Xác định độc tố của vi khuẩn ETEC gây tiêu chảy trên heo con bằng phƣơng pháp PCR phƣơng pháp PCR
Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phƣơng pháp invitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại
Hình 3.2: Định danh chủng vi khuẩn E. coli bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính
Kháng thể chuẩn K88, K99, 987P Phản ứng dƣơng tính (có ngƣng kết) Phản ứng âm tính (không có ngƣng kết) Vi khuẩn E. coli Đối chứng âm E. coli K88, K99, 987P
34
nhân số lƣợng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ vào hoạt động của enzyme polymerase và các cặp mồi (primer) đặc hiệu cho DNA này. Hiện nay kĩ thuật này đƣợc sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo các gene, chuẩn đoán bệnh, phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm…
Trong chuẩn đoán xác định độc tố ruột vi khuẩn ETEC hiện nay thì phƣơng pháp PCR đƣợc đánh giá là phƣơng pháp có độ nhạy cao, cho kết quả nhanh và phù hợp. PCR gồm nhiều chu kì nối tiếp nhau. Mỗi chu kì gồm 3 bƣớc (Trần Linh Thƣớc, 2010):
Bước 1 (biến tính – denaturation): trong một dung dịch phản ứng gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA thƣờng đƣợc biến tính ở nhiệt độ cao, thƣờng là 94 – 950C. Mạch đôi DNA tách ra thành dạng mạch đơn.
Bước 2 (bắt cặp – anealation): trong bƣớc này nhiệt độ đƣợc hạ thấp cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động từ 40 – 700
C.
Bước 3 (tổng hợp – elongation): nhiệt độ đƣợc tăng lên đến 720C giúp cho enzyme polymerase (vốn là polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt nhất, thời gian của bƣớc này phụ thuộc vào trình tự DNA cần khuếch đại, thƣờng kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
Xác định các độc tố đƣờng ruột của vi khuẩn E. coli bằng phản ứng PCR nhƣ mô tả của Lee et al., (2008).
Chiết tách DNA mẫu (DNA template)
Mẫu DNA của vi khuẩn E. coli đƣợc chiết tách bằng phƣơng pháp sốc nhiệt.
Chuẩn bị: khuẩn lạc của vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng NA sau 24 giờ, nƣớc cất tinh khiết không chứa DNA, RNA.
Cách thực hiện:
Dùng pipette hút 1ml nƣớc cất tinh khiết cho vào ống eppendorf.
Dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên môi trƣờng NA (lấy đầy que cấy) cho vào ống eppendorf trên.
Trộn đều bằng máy vortex. Đun sôi ở 1000C trong 10 phút. Ly tâm 15.000 vòng/15 phút.
Thu hoạch phần dịch nổi bên trên có chứa DNA của tế bào vi khuẩn, bảo quản ở -200
35
Đoạn mồi dùng trong phản ứng PCR
Trình tự nucleotide các cặp mồi dùng để xác định độc tố của vi khuẩn E. coli
dựa theo Kim et al., (2010).
Bảng 3.2: Trình tự nucleotide và kích thƣớc các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR xác định các yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli (Kim et al.,
2010) Gene mục tiêu Trình tự nucleotide (5’ – 3’) Kích thƣớt sản phẩm (bp) LT ATTTACGGCGTTACTATCCTC TTTTGGTCTCGGTCAGATATG 281 STa GCTAATGTTGGCAATTTTTATTTCTGTA AGGATTACAACAAAGTTCACAGCAGTAA 190 STb GCCTATGCATCTACACAATA TGAGAAATCGACAATGTCCG 279
Hỗn hợp nhiên liệu trong phản ứng
Phản ứng PCR phát hiện gene qui định một số yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli đƣợc thực hiện với tổng thể thể tích 25 µl với các hóa chất do Promega (USA) sản xuất và cung cấp.
Bảng 3.3: Hỗn hợp master mix của phản ứng PCR xác định một số yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy trên heo con (Promega Corporation, USA)
STT Thành phần Số lƣợng
1 Nƣớc tinh khiết không chứa DNA, RNA 9,5 µl
2 Master Mix 2X 12,5 µl
3 Mồi xuôi 0,5 µl
4 Mồi ngƣợc 0,5 µl
5 DNA mẫu 2 µl
Tổng 25 µl
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
36
Bảng 3.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR xác định các yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli (Kim et al., 2010)
Gene mục tiêu Chu trình nhiệt Tiền biến tính (0C/phút) Biến tính (0C/phút) Gắn mồi (0C/phút) Kéo dài (0C/phút) Kết thúc (0C/phút) Lặp lại chu kì 30 lần LT STa STb 94/10 94/10 94/10 94/1 52/10 72/1:30 94/1 55/10 72/1:30 94/1 51/10 72/1:30 72/10 72/10 72/10 Phương pháp điện di sản phẩm PCR
Sau khi thực hiện phản ứng PCR, sản phẩm đƣợc điện di trên thạch agarose 1,5%, dung môi điện di là TAE 1X buffer. Hút 10 µl DNA ladder cho vào giếng thứ nhất của gel agarose, giếng thứ 2 và giếng thứ 3 lần lƣợt cho 10 µl đối chứng dƣơng và đối chứng âm, kể từ giếng thứ 4 trở đi cho vào 10 µl sản phẩm PCR. Sau đó đặt gel vào buồng điện di và chạy ở hiệu điện thế 50V trong thời gian 1 giờ.
Nhuộm bản gel agarose trong Ethidium bromide
Sau khi kết thúc quá trình điện di, cho gel agarose vào dung dịch Ethidium bromide, trong thời gian 30 phút.
Đọc kết quả và chụp ảnh
Sau khi nhuộm bản gel trong Ethidium bromide xong, gel đƣợc đƣa vào buồng đọc kết quả dƣới đèn tia UV và chụp ảnh.
Kích thƣớc các đoạn gel sau khi khuếch đại đƣợc xác định dựa vào thang DNA chuẩn 100bp.
3.3.5 Các chỉ tiêu theo dõi
Khảo sát điều kiện tự nhiên và tình hình chăn nuôi của huyện Vũng Liêm, Long Hồ và thành phố Vĩnh Long.
Tỷ lệ tiêu chảy trên heo con tại huyện Vũng Liêm, Long Hồ và thành phố Vĩnh Long.
37
Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E. coli trên heo con theo địa điểm. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E. coli trên phân heo con theo lứa tuổi.
Tỷ lệ định danh các chủng vi khuẩn E. coli K88, K99, 987P trên heo con theo địa điểm
Tỷ lệ định danh các chủng vi khuẩn E. coli K88, K99, 987P trên heo con theo mẹ và sau cai sữa.
Kết quả xác định độc tố của vi khuẩn ETEC gây tiêu chảy trên heo con.
3.4 Phƣơng pháp xử lí số liệu
Số liệu đƣợc xử lí thống kê theo Phƣơng pháp Chi – square bằng phần mềm Minitab 16.0, Chi square Yates và Fixer Exactly Test bằng phần mềm Excel 2010.
38
CHƢƠNG 4
KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 Khảo sát điều kiện tự nhiên và tình hình chăn nuôi tại huyện Vũng Liêm, Long Hồ và thành phố Vĩnh Long Liêm, Long Hồ và thành phố Vĩnh Long
Vị trí địa lí
Vĩnh Long là tỉnh nằm ở trung tâm châu thổ đồng bằng Sông Cửu Long, thuộc vùng giữa sông tiền và sông hậu, cách Thành phố Hồ Chí Minh 136 km với tọa độ địa lý từ 90 52‟ 45‟‟ đến 100 19‟ 50‟‟ vĩ độ bắc đến 1040 41‟ 25‟‟ đến 1060 17‟ 00‟‟. Phía Bắc và Đông Bắc giáp tỉnh Tiền Giang và Bến Tre, phía Đông Nam giáp tỉnh Trà Vinh, phía tây giáp tỉnh Hậu Giang và thành phố Cần Thơ, phía Tây Bắc giáp tỉnh Đồng Tháp.
(http://www.vinhlong.gov.vn/Default.aspx?tabid=57)
Vĩnh Long có diện tích tự nhiên 1.479.128 km2
bằng 0,4% diện tích cả nƣớc, dân số năm 2013 trên 1.029.600 ngƣời.
39
Địa hình
Vĩnh Long có địa thế trải rộng dọc theo sông Tiền và sông Hậu, thấp dần xuống phía nam, địa hình tƣơng đối bằng phẳng, cao trình khá thấp so với mực nƣớc biển. Cao trình tuyệt đối từ 0,6 đến 1,2 mét chiếm 90% diện tích, phần còn lại là thành phố Vĩnh Long và thị cửa sông, tiểu địa hình của tỉnh có dạng lòng chảo ở giữa trung tâm tỉnh và cao dần về hai hƣớng sông Tiền, sông Hậu, sông Măng Thít và ven các sông rạch lớn.
Khí hậu
Vĩnh Long nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, quanh năm nóng ẩm, có chế độ nhiệt tƣơng đối cao và bức xạ dồi dào. Độ ẩm không khí trung bình 74 – 83%. Lƣợng mƣa trung bình hàng năm là 1450 – 1504 mm/năm, thời gian mƣa tập trung vào tháng 5 đến tháng 11 dƣơng lịch.
Tình hình chăn nuôi
Theo số liệu thống kê đến tháng 4/2013 tỉnh Vĩnh Long có tổng số 275.829 con heo, trong đó có 235.840 con heo thịt, 39.587 con heo nái, 402 con heo đực giống (channuoivietnam.com).
Các mẫu phân heo con theo mẹ và sau cai sữa đƣợc thu thập tại các nông hộ của huyện Vũng Liêm, Long Hồ và thành phố Vĩnh Long. Tại các nông hộ heo đƣợc nuôi bằng thức ăn hỗn hợp, tự chế biến và thức ăn tận dụng, vì vậy thành phần dinh dƣỡng trong thức ăn không ổn định, không phù hợp với từng giai đoạn phát triển và lứa tuổi của heo, đây là một trong những nguyên nhân gây tiêu chảy cho heo con. Chuồng nuôi heo đa số là kiểu chuồng hở, máng ăn thiết kế nằm trong chuồng, có vòi uống cho heo, nền chuồng làm bằng xi măng và đƣợc vệ sinh bằng nƣớc hằng ngày. Thức ăn thừa chƣa đƣợc quan tâm vệ sinh, đây là nguyên nhân để các loại vi khuẩn có hại phát triển. Công tác vệ sinh sát trùng chƣa đƣợc chú trọng, các nông hộ chỉ sát trùng thƣờng xuyên khi có dịch bệnh xảy ra. Ngoài ra, chuồng nuôi chƣa đƣợc cách ly tốt, các vật nuôi nhƣ chó, gà, vịt có thể vào chuồng nuôi tìm thức ăn thừa tự do, đây chính là nguy cơ phát tán mầm bệnh trong chuồng.
4.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ bệnh tiêu chảy trên heo con tại huyện Vũng Liêm, Long Hồ và thành phố Vĩnh Long
Qua thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi đã tiến hành khảo sát 192 con heo tiêu chảy trong tổng số 612 con heo tại các hộ chăn nuôi thuộc huyện Vũng Liêm, Long Hồ và thành phố Vĩnh Long. Kết quả khảo sát tỷ lệ bệnh tiêu chảy trên heo con đƣợc trình bày trong bảng 4.1.
40
Bảng 4.1: Kết quả khảo sát tỷ lệ bệnh tiêu chảy trên heo con tại huyện Vũng Liêm, Long Hồ và thành phố Vĩnh Long
Kết quả khảo sát tỷ lệ bệnh tiêu chảy trên heo con là khá cao (30,92%), trong đó thành phố Vĩnh Long chiếm tỷ lệ cao nhất 35,19%, Vũng Liêm và Long Hồ chiếm tỷ lệ thấp hơn là 27,43% và 32,25%. Tuy nhiên, sự khác biệt về tỷ lệ tiêu chảy của 3 địa điểm trên là không có ý nghĩa thống kê (P=0,286). Kết quả này có thể đƣợc giải thích do mẫu đƣợc lấy tại 3 huyện vào cùng thời điểm là vào mùa mƣa nên môi trƣờng ngoại cảnh là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến sức đề kháng của gia súc, chính điều này làm cho heo con rất dễ cảm nhiễm với bệnh tiêu chảy. Thêm vào đó, mẫu phân heo tiêu chảy chủ yếu đƣợc thu thập tại nông hộ nên cách chăm sóc nuôi dƣỡng chƣa đƣợc đảm bảo, ủ ấm không tốt nên heo con dễ bị lạnh (Hình 4.2), dẫn đến suy giảm sức đề kháng, ảnh hƣởng đến khả năng tiêu hóa thức ăn của heo con, vì vậy những vi sinh vật trong đƣờng ruột có cơ hội để phát triển nhất là vi khuẩn E. coli.
Tại các địa điểm lấy mẫu, các loại thức ăn thƣờng đƣợc nông hộ sử dụng trong nuôi heo con là thức ăn hỗn hợp, tổng hợp tự chế biến và cả thức ăn tận dụng, vì vậy thành phần dinh dƣỡng trong thức ăn không ổn định, không phù hợp với từng giai đoạn phát triển và lứa tuổi của heo. Có lẽ chính sự thay đổi thức