Dùng làm vật liệu y sinh học và dƣợc phẩm: Chitosan có khả năng tƣơng hợp sinh học với mô và tế bào do đó có thể sử dụng cấy ghép vào trong mô động vật. Vì
Trần Văn Toàn 23
vậy, ngƣời ta sử dụng chitosan làm vật liệu y sinh học mới nhƣ chỉ khâu tự tan trong phẫu thuật, da nhân tạo trong điều trị bỏng và vết thƣơng, kính áp tròng trong điều trị các bệnh về mắt. Ngoài ra, ngƣời ta còn nghiên cứu chitosan dạng ống để tái sinh dây thần kinh.
Trong điều trị vết thƣơng, chitosan có tác dụng cầm máu, đẩy nhanh quá trình phát triển các tế bào ở vùng mô bị tổn thƣơng, mau làm lành vết thƣơng và giảm nhiễm trùng. Trong trƣờng hợp bị bỏng, chitosan có thể tạo thành ở dạng màng xốp hút nƣớc mạnh và giúp cho oxy phân tán qua màng vào mô tổn thƣơng rất dễ dàng, tạo điều kiện cho các mô này bình phục nhanh chóng.
Trong dƣợc phẩm, chitosan đƣợc sử dụng nhƣ chất mang an toàn, có khả năng phóng thích thuốc từ từ trong cơ thể, kéo dài tác dụng của thuốc hay vật liệu cố định enzym và điều trị.
Hoạt tính giảm đau của chitosan: Các nhà khoa học cho rằng chitin và chitosan đều có hoạt tính giảm đau, trong đó chitosan có hoạt tính cao hơn. Các nhà nghiên cứu giải thích rằng, cơ chế của hoạt tính giảm đau của chitosan là sự hấp thụ các ion mang điện tích dƣơng đƣợc giải phóng ra từ các vùng bị viêm nhiễm. Do chitosan là một polycatinoic tự nhiên, nên các nhóm amino của chitosan có thể bị proton hóa và làm giảm pH, đây là nguyên nhân chính làm giảm các cơn đau.
Giảm huyết áp cao: Nhƣ chúng ta đã biết, huyết áp cao là do ion clo trong muối, nó kích hoạt một enzym có tên là men chuyên Angiotensin, là nguyên nhân làm co mạch máu và huyết áp trở nên cao hơn. Tại đây, chitosan có khả năng kết hợp ion clo đƣợc tích điện trong muối rồi thải chúng ra ngoài.
Hỗ trợ điều trị viêm loét dạ dày-tá tràng: Chitosan nhờ môi trƣờng acid ở dạ dày tạo thành gel che phủ niêm mạc và phát huy tác dụng bảo vệ niêm mạc. Năm 1999, các nhà nghiên cứu Nhật đã thử nghiệm khả năng chống loét dạ dày của chitosan ở chuột, tác dụng bảo vệ này tƣơng đƣơng với thuốc sucralfat. Chitosan cũng đƣợc chứng minh có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn, trong đó có vi khuẩn Helicobacter, một loại vi khuẩn gây ra bệnh viêm loét dạ dày- tá tràng. Tuy nhiên, đó mới là nghiên cứu dƣợc lý thực nghiệm. Cho đến nay, chitosan vẫn đƣợc sử dụng nhƣ thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị căn bệnh này.
Đặc tính chống ung thƣ: Hoạt tính kháng ung thƣ của chitosan chính là ức chế sự phát triển của các tế bào khối u và nhờ đó kích thích khả năng miễn dịch của cơ thể. Một số nhà khoa học đã tiến hành thử nghiệm trên invitro và invivo (một số các
Chương 2: Tổng quan tài liệu
Trần Văn Toàn 24
chitosan oligomer) để đi đến kết luận rằng: “Các oligomer này có khả năng kháng ung thƣ”. Các nhà khoa học đã sử dụng một lƣợng lớn chuột và cho chúng ăn chitosan cũng có khả năng kháng vi trùng. Một số nhà khoa học khác lại nghiên cứu khả năng ức chế sự phát triển và sự di căn của tế bào khối u. Các cuộc thử nghiệm invivo cho thấy việc kích hoạt sự hoạt động của tế bào bạch cầu của chitosan là một bƣớc trung gian trong quá trình ức chế sự phát triển của các tế bào khối u.
Chitosan có khả năng tăng cƣờng miễn dịch tế bào, kích hoạt tế bào hạch, có khả năng làm cho pH của dịch thể tăng cao. Từ đó tạo ra môi trƣờng kiềm tính, tăng cƣờng chức năng tế bào hạch tấn công tế bào ung thƣ tƣơng đối tốt, kích thích sự sản sinh ra các tế bào chữ T ở tuyến tụy. Ung thƣ đáng sợ bởi chúng có nhiều tính khuếch tán. Bằng nhiều phƣơng pháp, các nhà khoa học đã chứng thực: Chitosan có tác dụng ức chế tính khuếch tán của tế bào ung thƣ và thu đƣợc những thành công đáng kể trong thực nghiệm lâm sàn. Chitosan còn có đặc tính bám chặt vào các phân tử ở bề mặt tế bào biểu bì trong huyết quản. Và nó có khả năng phong tỏa tế bào ung thƣ, không cho ung thƣ lây lan sang các tế bào biểu bì trong huyết quản. Vì vậy, chitosan có tác dụng ngăn chặn bộ phận ung thƣ phát tán ra xung quanh.
Chitin-chitosan và các oligomer của nó có đặc tính miễn dịch, do nó kích thích các tế bào giữ nhiệm vụ bảo vệ miễn dịch với các tế bào khối u, và các tác nhân gây bệnh. Năm 2003, các bác sĩ bệnh viện K Hà Nội đã chứng minh chitosan có tác dụng hỗ trợ điều trị ung thƣ trên 60 bệnh nhân từ 35-76 tuổi. Chitosan dùng kèm chiếu xạ và hóa chất có tác dụng giảm tác dụng phụ và tăng thể lực, cải thiện công thức máu, giảm cholesterol cho bệnh nhân.
Ngoài ra, chitosan còn có tác dụng hỗ trợ điều trị tiểu đƣờng, dùng làm tá dƣợc cho nhiều loại thuốc uống. Năm 2002, ở Anh ngƣời ta đã thành công trong việc dùng chitosan làm tá dƣợc cho insulin, đƣợc sử dụng phun qua mũi (các thử nghiệm đã thành công ở chuột và cừu). Trong tƣơng lai, chitosan hứa hẹn là một tá dƣợc hiệu quả trong bào chế nhiều loại thuốc và vacxin.
2.8 Cơ sở lý thuyết điều chế chitin-chitosan
2.8.1 Thành phần vỏ tôm
Thông thƣờng, vỏ tôm dùng điều chế chitin-chitosan có 2 dạng là vỏ tôm tƣơi và vỏ tôm khô tùy vào nghiên cứu của từng tác giả. Tùy mục đich nghiên cứu mà nguyên liệu vỏ tôm có thể phân biệt ra làm vỏ đầu tôm hoặc vỏ thân tôm. Trong đề
Trần Văn Toàn 25
tài này, tôi sử dụng nguyên liệu là vỏ tôm khô, bao gồm cả vỏ đầu tôm và thân tôm đƣợc lấy ngẫu nhiên.
Các thành phần chính trong vỏ tôm là: protein, các muối canxi, lipit, chitin, sắc tố astaxanthin, và các chất khác….Thành phần vỏ tôm có thể thay đổi theo phƣơng pháp và điều kiện thả nuôi cũng nhƣ theo từng giai đoạn phát triển của tôm.
Bảng 2.2: Hàm lƣợng các thành phần chính trong vỏ tôm [2] Stt Thành phần Hàm lƣợng trong vỏ tôm tƣơi (%) Hàm lƣợng trong vỏ tôm khô (%) 1 Muối canxi 12,25 45,16 2 Protein 8,05 23,25 3 Chitin 4,50 27,50 4 Astaxanthin Rất ít Rất ít
2.8.2 Các bƣớc cơ bản điều chế chitosan
2.8.2.1 Loại khoáng
Thành phần khoáng trong vỏ tôm chủ yếu là muối CaCO3 và rất ít Ca3(PO4)2. Do đó, các tác nhân thƣờng đƣợc sử dụng để loại khoáng thƣờng là các acid nhƣ: HCl, H2SO4, CH3COOH… Nhƣng HCl thƣờng đƣợc sử dụng nhiều nhất, do nó có khả năng loại khoáng cho hiệu quả cao, không gây ra các phản ứng phụ và không sinh ra các chất khó tan.
CaCO3 + HCl CaCl2 + CO2 + H2O (2.3)
Chương 2: Tổng quan tài liệu
Trần Văn Toàn 26
Trong quá trình này, tôi khảo sát 3 yếu tố là thời gian loại khoáng, nồng độ dung dịch HCl và nhiệt độ tiến hành thí nghiệm đến hiệu suất loại khoáng. Đồng thời, khảo sát sự ảnh hƣởng của các yếu tố trên đối với chất lƣợng chitosan thành phẩm nhƣ thế nào thông qua việc kiểm tra các chỉ tiêu hàm lƣợng tro, độ deacetyl hóa của chitosan thành phẩm.
Theo các nghiên cứu đã đƣợc công bố trong quá trình loại khoáng bằng dung dịch HCl thì nồng độ HCl có ảnh hƣởng rất lớn đến thời gian, hiệu quả khử khoáng và chất lƣợng chitosan thành phẩm. Nồng độ HCl cao sẽ rút ngắn thời gian khử khoáng; tuy nhiên, nó sẽ làm cắt mạch polysaccharide làm giảm chất lƣợng chitosan, và nếu nồng độ HCl quá cao có thể tạo thành glucosamin. Ngƣợc lại, nồng độ thấp thì thời gian khử khoáng kéo dài, thậm chí nồng độ HCl quá thấp thì việc loại khoáng sẽ không triệt để.
Thời gian tiến hành loại khoáng cũng rất quan trọng, nếu thời gian ngắn quá thì hiệu quả khử khoáng sẽ không cao. Nếu loại khoáng quá lâu thì sẽ làm chậm đến hiệu suất của quá trình sản xuất và ảnh hƣởng xấu đến chất lƣợng chitosan. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ngoài ra, nhiệt độ cũng quyết định đến tốc độ, hiệu suất của quá trình loại khoáng và chất lƣợng chitosan. Nhiệt độ cao thì loại khoáng sẽ nhanh hơn, nhƣng nếu nhiệt độ quá cao thì làm bay hơi HCl làm giảm hiệu suất quá trình và gây ô nhiễm môi trƣờng, đồng thời nhiệt độ cao cũng làm thủy phân cắt mạch polysaccharide, làm giảm chất lƣợng chitosan.
Từ các vấn đề trên ta thấy, chọn lựa các thông số nhiệt độ, nồng độ HCl và thời gian tiến hành loại khoáng để xây dựng một quy trình điều chế chitosan trong phòng thí nghiệm cũng nhƣ sản xuất là việc làm cần thiết
2.8.2.2 Loại protein và deacetyl hóa
Protein là một hợp chất đại phân tử đƣợc tạo thành từ rất nhiều các đơn phân là các axit amin. Axit amin đƣợc cấu tạo bởi ba thành phần: một là nhóm amin (- NH2), hai là nhóm cacboxyl (-COOH) và cuối cùng là nguyên tử cacbon trung tâm đính với 1 nguyên tử hyđro và nhóm biến đổi R quyết định tính chất của axit amin. Ngƣời ta đã phát hiện ra rằng có tất cả 20 axit amin trong thành phần của tất cả các loại protein khác nhau trong cơ thể sống [14].
Trần Văn Toàn 27
Cấu trúc bậc một: Các axit amin nối với nhau bởi liên kết peptit hình thành nên chuỗi polypeptide. Đầu mạch polypeptide là nhóm amin của axit amin thứ nhất và cuối mạch là nhóm carboxyl của axit amin cuối cùng.
Cấu trúc bậc hai: là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptide trong không gian. Chuỗi polypeptide thƣờng không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc xoắn α và cấu trúc nếp gấp β, đƣợc cố định bởi các liên kết hyđro giữa những axit amin ở gần nhau.
Cấu trúc bậc ba: Các xoắn α và phiến gấp nếp β có thể cuộn lại với nhau thành từng búi có hình dạng lập thể đặc trƣng cho từng loại protein. Cấu trúc không gian này có vai trò quyết định đối với hoạt tính và chức năng của protein.
Cấu trúc bậc bốn: Khi protein có nhiều chuỗi polypeptide phối hợp với nhau thì tạo nên cấu trúc bậc bốn của protein. Các chuỗi polypeptide liên kết với nhau nhờ các liên kết yếu nhƣ liên kết hyđro.
Về tính chất, do có cấu trúc phức tạp nên có nhiều tính chất khác nhau, trong đó có tính chất thủy phân. Khi đun nóng trong môi trƣờng acid hay kiềm mạnh, các phân tử H2O sẽ tấn công vào các liên kết peptide và cắt protein thành các peptide nhỏ hơn và cuối cùng thành các amino acid. Lợi dụng tính chất này, ta loại protein ra khỏi vỏ tôm bằng kiềm đặc.
Rất nhiều tác nhân đã đƣợc nghiên cứu sử dụng để loại protein nhƣ: NaOH, KOH, K2CO3... Nhƣng NaOH vẫn là tác nhân đƣợc ƣa chuộng sử dụng nhiều nhất do tính phổ biến và khả năng loại protein tốt của nó.
Deacetyl hóa là công đoạn chuyển hóa nhóm -NHCOCH3 thành nhóm NH2 và loại nhóm –CH3CO chuyển thành muối CH3COONa. Để thực hiện quá trình trên, ngƣời ta thƣờng dùng kiềm đặc ở nhiệt độ cao, dựa vào tính chất của chitosan là tan đƣợc trong dung dịch axit loãng tạo thành dung dịch keo trong suốt, trong khi chitin thì không tan. Kiểm tra sơ bộ mức độ chuyển hóa chitin thành chitosan bằng cách lấy một ít sản phẩm cho vào acid acetic 1% nếu sản phẩm tan thành keo trong suốt là đƣợc.
Tƣơng tự quá trình loại khoáng, trong quá trình này, các nhân tố thời gian, nồng độ NaOH và nhiệt độ tiến hành thí nghiệm cũng ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu suất của quá trình và chất lƣợng chitosan đƣợc tạo ra.
Chương 2: Tổng quan tài liệu
Trần Văn Toàn 28
Do phải deacetyl hóa ở nhiệt độ cao nên thời gian lâu sẽ ảnh hƣởng rất lớn đến độ nhớt của chitosan thành phẩm, nhƣng nếu thời gian tiến hành phản ứng quá nhanh có thể dẫn đến việc loại protein không hết hoặc deacetyl chƣa đạt yêu cầu.
Nồng độ dung dịch NaOH cũng phải đƣợc chọn thật hợp lý để có thể loại triệt để protein và khử nhóm –CH3CO đến độ DD đạt yêu cầu, và tránh lãng phí hóa chất, do giai đoạn này sử dụng dung dịch NaOH nồng độ cao nên hóa chất tiêu tốn sẽ rất nhiều nếu điều chế với quy mô lớn. Nên hiệu quả kinh tế là điều cần phải tính đến.
2.8.2.3 Tẩy màu
Trong vỏ các loại giáp xác có chứa các phân tử mang màu chủ yếu là các dẫn xuất carotenoid. Các chất này không liên kết với khoáng cũng nhƣ với protein nên vẫn không bị loại bỏ sau khi loại khoáng và protein. Để loại bỏ các sắc tố màu này, ngƣời ta thƣờng dùng các chất có tính oxy hóa nhƣ: H2O2, nƣớc javel (NaOCl+NaCl), Na2S2O3, KMnO4+C2H2O4…
Công đoạn này, ta thƣờng dùng các chất có tính oxy hoá khử để tẩy màu của nguyên liệu. Đây là giai đoạn quyết định giá trị cảm quan của sản phẩm. Trong thực tế, ngƣời ta thƣờng sử dụng KMnO4 để khử màu. Bởi vì, ngoài tác dụng khử màu thì KMnO4 còn có tác dụng khử một số tạp chất trong quá trình ngâm axit và ngâm xút, một số tạp chất chƣa bị khử.
29
Chƣơng 3
PHƢƠNG PHÁP VÀ PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
3.1 Nguyên liệu, hóa chất, các dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
Nguyên liệu: Vỏ tôm sú đã đƣợc phơi khô, đƣợc lấy ngẫu nhiên từ các vựa tôm tại Cà Mau.
Hóa chất sử dụng: HCl, NaOH, C2H2O4, H2SO4, acid boric xuất sứ Trung Quốc. KMnO4 sản xuất tại Việt Nam, các loại giấy lọc, quỳ tím,…
Thiết bị: máy chƣng cất lôi cuốn đạm, bể điều nhiệt, máy nung tro, cân phân tích, tủ sấy, bình hút ẩm…
Dụng cụ: bình tam giác loại 250ml và 500ml, cốc thủy tinh, ống đong…
Chọn tỉ lệ hóa chất sử dụng tỉ lệ giữa khối lƣợng vỏ tôm nguyên liệu và thể tich dung dịch HCl, NaOH đƣợc chọn là w/v=1/10. Yêu cầu chọn tỉ lệ này là phải đảm bảo đủ HCl cho quá trình loại khoáng và NaOH để loại triệt để protein và deacetyl hóa đến mức yêu cầu. Để đảm bảo cho phản ứng xảy ra đông đều lƣợng dung dịch phải đảm bảo ngập toàn bộ nguyên liệu.
Tẩy màu bằng dung dịch KMnO4 1%, ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó, trung hòa KMnO4 bằng dung dịch acid oxalic 1%. Tiến hành rửa trung tính và các công đoạn tiếp theo. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chương 3: Phương pháp và phương tiện nghiên cứu
Trần Văn Toàn 30
Bảng 3.1: Các thông số đƣợc chọn cố định trong các thí nghiệm
Khối lƣợng nguyên liệu 30g vỏ tôm khô, đã đƣợc cắt nhỏ Loại khoáng Dung dịch HCl, tỉ lệ w/v=1/10 Tẩy màu KMnO4 1%, C2H2O4 2% w/v=1/10
Loại protein và deacetyl hóa
Dung dịch NaOH, tỉ lệ w/v=1/10
Sấy khô Tủ sấy, nhiệt độ 60oC trong 3 giờ
Rửa trung tính Rửa bằng nƣớc sạch nhiều lần, sau dó rửa lại bằng nƣớc cất
3.2 Bố trí thí nghiệm
Trong các quy trình điều chế chitosan đã giới thiệu ở Chƣơng 2, giai đoạn loại khoáng, tẩy màu và các công đoạn phụ không có nhiều khác biệt. Tuy nhiên, một số quy trình loại protein bằng kiềm loãng rồi sau đó mới deacetyl hóa bằng kiềm đặc, một số quy trình lại gộp cả 2 quá trình này lại thành một và sử dụng kiềm đặc ở nhiệt độ cao. Trong đề tài này, chúng tôi chọn quy trình cộng gộp 2 quá trình loại protein và deacetyl hóa thành một công đoạn. Vì nhƣ vậy, thí nghiệm sẽ đơn giản, giảm đƣợc nhiều thời gian và chi phí tiến hành thí nghiệm. Tuy nhiên, cách này cũng có một số nhƣợc điểm nhƣ: quá trình loại protein và deacetyl xảy ra đồng thời nên tốc độ và hiệu suất của việc loại protein, cũng nhƣ deacetyl hóa có thể bị ảnh hƣởng.
Các thí nghiệm đƣợc bố trí thực hiện theo phƣơng pháp một nhân tố thay đổi và cố định các nhân tố còn lại. Sau đó tuần tự các nhân tố sẽ đƣợc khảo sát qua từng