2. Yêu cầu
2.5.5đánh giá khả năng chịu hạn ở ngô bằng công nghệ sinh học phân tử
Khả năng chịu hạn ựược quy ựịnh bởi nhiều gen (multigenic). Sử dụng các công cụ sinh học phân tử hiện ựại ựể làm sáng tỏ cơ chế kiểm soát của khả năng chịu hạn trong môi trường tress (hạn) ựược dựa trên biểu hiện của gen giúp cải thiện tình trạng hạn hán (Amudha J. và G. Balasubramani, 6/2010). Các gen kháng hạn hán cung cấp nền tảng khoa học ựể cải thiện năng suất của cây trồng trong ựiều kiện khô hạn và góp phần cải thiện và ổn ựịnh sản lượng.
Trong các tắnh trạng hình thái thì ASI quan trọng nhất, do vậy ựược quan tâm nghiên cứu kỹ (Hall và cộng sự 1982, Wesgate và Bussetti 1990, Bolanos và Edmeades 1993Ầ) các kết quả ựều ựánh giá ASI tương quan nghịch với năng suất hạt trong ựiều kiện hạn, chọn lọc năng suất dựa trên ASI trong ựiều kiện hạn cho kết quả khả quan nhất, có khả năng di truyền (Bolanos và cộng sự 1993). Vấn ựề ựặt ra làm thế nào ựể nhận biết ựược các QTLs quy ựịnh ASI trên các NST ở ngô. Những báo cáo ựầu tiên về sử dụng chỉ thị phân tử trong nhận biết QTLs trên các vùng genome ựược Paterson và cộng sự ựề cập (1988) khi sử dụng chỉ thị RFLP. Chỉ thị này ựã xác ựịnh ựược các thành phần di truyền theo quy luật Menden và tắnh dị hợp của các locus, bước ựầu lập ựược bản ựồ QTLs của một số tắnh trạng hình thái, thể hiện tắnh ựa hình di truyền của các genotype (Burr 1991; Helẹnteris và cộng sự 1986; Burr và cộng tác 1988); ựề cập tới các tắnh trạng trong ựiều kiện hạn (Ribaut 1996). Xác ựịnh ựược các vùng genome nằm trên NST 1, 2, 5, 6, 8, 10 liên kết với ASI, xây ựựng ựược hệ thống chỉ thị nhận biết các tắnh trạng liên quan với khả năng chịu hạn (Rebai và cộng sự 1997; Sari Ờ Gola và cộng sự 1999).
đối với các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất cũng ựược Rebaut (1997); Flora (1998) nghiên cứu cho thấy tắnh trạng số bắp/ cây, chiều dài bắp, hạt trên hàng tương quan với năng suất và có tới 60% chỉ thị RFLP liên quan chặt với các tắnh trạng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 24 trên. Khi so sánh với ASI thì ASI tượng quan chặt hơn. Tuy nhiên khi áp dụng kết quả trên trong chọn lọc gặp khó khăn.
Chọn tạo giống ngô chịu hạn nhằm ựáp ứng ngày càng tốt hơn ựối với sự biến ựổi của môi trường là một trong những hướng ựược các nhà tạo giống ưu tiên. Sinh học phân tử ựã giúp các nhà tạo giống xác ựịnh ựược một số chỉ thị di truyền ựặc trưng cho tắnh chịu hạn, trên cơ sở ựó xác ựịnh chắnh xác nguồn vật liệu chịu hạn ựồng thời tăng hiệu quả quá trình chọn lọc hợp tử.
Nhờ ứng dụng công nghệ sinh học phân tử, những nguồn có mang các gene chống chịu ựược nhận biết. Vắ dụ nghiên cứu sự chênh lệch thời gian TP Ờ PR (ASI) ở ngô ựã xác ựịnh 6 QTL ở trên các nhiễm sắc thể 1, 2, 5, 6, và 10, quy ựịnh tới 50% sự biểu hiện ASỊ Những nghiên cứu sâu hơn về tắnh chịu hạn của ngô ựã ựược nhiều quốc gia tiến hành, ựặc biệt là các gen mã hoá cho các protein LEA D-11 (dehydrin -
Dhn), gen Dhn khu trú trên NST 1, 3, 4, 5, 6, 9 (gồm 6 nhóm khác nhau) với chức năng chống mất nước, chịu nhiệt ựộ thấp, nhiệt ựộ cao, ựộ ẩm thấp, ựiều chỉnh hàm lượng Acid Abscisic (ABA) (Bùi Mạnh Cường, 2007).
Nhưng khó khăn lớn là phần lớn những ựặc tắnh chống chịu do ựa gen quy ựịnh và các nguồn ngô khác nhau thì biểu hiện khả năng chịu hạn ở các môi trường cũng không không như nhaụ Vắ dụ hiện nay nhiều công trình nghiên cứu ựã khẳng ựịnh rằng chống chịu hạn, mặn, và nhiệt ựộ thấp thường có liên hệ sinh lý với nhaụ Vì 3 loại môi trường bất thuận ựều dẫn ựến hạn chế cây trồng hút nước. Vì thế nhiều chiến lược cải tạo chống chịu khác nhau dường như ựều có thể áp dụng lẫn nhau ựược như ựiều chỉnh áp suất thẩm thấu ở bộ rễ và lá ựể duy trì nước, sức trương nước của bộ rễ và lá ựể duy trì nước và cải thiện khả năng vận chuyển nước trong câỵ Vì vậy các nhà khoa học sinh lý, di truyền mong muốn nghiên cứu, phát hiện càng nhiều khả năng chống chịu trong một giống càng tốt.
để ựạt ựược hiệu quả chọn lọc như trên thì cần thu thập ựược tập ựoàn nguyên liệu có biến ựộng di truyền về tắnh trạng chống chịu hạn, ựánh giá chắnh xác khả năng chống chịu hạn của các vật liệu ngô và ựiều khiển ựúng môi trường ựánh giá và có thể áp dụng ựược cường ựộ chọn lọc cao khi chọn lọc về tắnh trạng chịu hạn ở ngô. Muốn ựạt ựược các kỹ năng trên, nhà chọn giống cần hiểu ựược phản ứng của cây ngô trong
ựiều kiện hạn, nắm ựược phương pháp quản lý ựồng ruộng thắ nghiệm và sử dụng ựúng hệ thống các chỉ tiêu gián tiếp liên quan ựến năng suất trong ựiều kiện hạn (Banziger and Lafitte, 1997; Banzinger, Edmeades và cộng sự, 2000), năng ựộng cải tiến các sơ ựồ thắ nghiệm so sánh, chọn giống trong quá trình chọn lọc, sao cho phù hợp với hoàn cảnh, cơ sở vật chất và phương tiện nghiên cứụ
Việc lựa chọn phương pháp ựánh giá dựa vào loại chỉ thị di truyền nào phụ thuộc vào mục ựắch của người nghiên cứu: chỉ thị hình thái, chỉ thị sinh hoá, chỉ thị phân tử ADN.
Các chỉ thị phân tử ADN ựược phân chia theo 2 nhóm chắnh sau: + Chỉ thị phân tử dựa trên cơ sở lai ADN hay chỉ thị RFLP;
+ Chỉ thị phân tử dựa trên cơ sở nhân bản ADN bằng kỹ thuật PCR: RAPD, AFLP, SSR, STS, SNP Ầ.
Các chỉ thị phân tử cũng ựã ựược nghiên cứu và ứng dụng trong công tác chọn tạo giống ngô lai ở Việt Nam: sử dụng chỉ thị RAPD, SSR trong phân tắch ựa dạng di truyền tập ựoàn dòng, phân nhóm và dự ựoán ưu thế laị
Với phương pháp chọn giống truyền thống, quá trình khảo sát ựồng ruộng cần giải quyết khối lượng rất lớn công việc ựòi hỏi nhiều kinh phắ cũng như thời gian. Công việc này tới nay vẫn chưa có kết quả thật ựáng tin cậy do tương tác giữa gen với môi trường và phức tạp. Chọn giống chịu hạn nhờ chỉ thị phân tử dựa vào các bản ựồ QTLs (quantitative trait loci) ựể rút ngắn thời gian và giảm bớt công việc ựánh giá ựồng ruộng với niềm tin có thể ựạt kết quả tốt hơn (Tuberosa và cộng sự, 2002).
Các nhà khoa học ựều thống nhất cơ chế chịu hạn của thực vật thuộc khả năng hút nước của hệ rễ, khả năng lánh hạn và khả năng chịu hạn. Trong 3 khả năng trên thì khả năng chịu hạn của thực vật ựược quan tâm nhiều (Shinnozaki, Yamaguchi, 2000). để ựánh giá khả năng chịu hạn người ta thường căn cứ vào các tắnh trạng hình thái, sâu hơn nữa là sử dụng chỉ thị phân tử. Tuy nhiên, ựối với chỉ thị hình thái thường không chắnh xác vì phụ thuộc vào ựiều kiện môi trường ựánh giá, còn sử dụng chỉ thị phân tử lại phụ thuộc vào mực ựộ chắnh xác của các hệ thống chỉ thị, khả năng di truyềnẦ để khắc phục nhược ựiểm của hai phương pháp trên người ta sử dụng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 26 phương pháp ựánh giá khả năng chịu hạn thông qua nhận biết hệ thống các gen quy ựịnh tắnh chịu hạn.
Trong các nhóm gen liên quan tới khả năng chịu hạn ở ngô 2 nhóm ựược nghiên cứu nhiều là nhóm quy ựịnh sự tổng hợp ABA trong ựiều kiện hạn (Rab15, Rab16, Rab17Ầ) và nhóm quy ựịnh tổng hợp protein bảo vệ màng tế bào, duy trì áp suất thẩm thấu chống mất nước là nhóm gen Dhn (Shinnozaki, Yamaguchi, 2000).
PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Ị Vật liệu, ựịa ựiểm và thời gian nghiên cứu
1. Vật liệu: Vật liệu là các mẫu giống ngô ựịa phương
STT Tên giống Kắ hiệu Xuất Xứ Phân loại
1 Slidim GT8 Thanh Xương , điện Biên Ngô tẻ 2 Tẻ vàng Sa seng bản GT17 Tả Phìn, Sapa, Lào Cai Ngô tẻ 3 Khẩu li chằm GT50 Bản Pó, Chiềng An, Sơn La Ngô tẻ 4 Pooc cừ ựa GT63 Xi Cơ, Keo Lôm, điện Biên Ngô tẻ 5 Pooc cừ làng GT69 TT Sìn Hồ, Lai Châu Ngô tẻ 6 Pooc cừ lây GT71 TT Sìn Hồ, Lai Châu Ngô tẻ 7 Hù Cha 1 GT73 Hoàng Su Phì, Hà Giang Ngô tẻ 8 Hù Cha 2 GT75 Hoàng Su Phì, Hà Giang Ngô tẻ 9 Bắp chăm 1 GT76 Hàm Yên, Tuyên Quang Ngô tẻ 10 Khâu Hù Khảo GN137 Hoàng Su Phì, HG Ngô nếp 11 Ngô nếp Lao chải GN144 Vị Xuyên, Hà Giang Ngô nếp 12 Ngô nếp Trung Thành GN146 Vị Xuyên, Hà Giang Ngô nếp 13 Xá li lượt GN151 Tân Uyên- Lai Châu Ngô nếp 14 Bắp Nu Hà Giang GN159 Vị Xuyên, Hà Giang Ngô nếp 15 Bắp Nua Khao 2 GN164 Vị Xuyên, Hà Giang Ngô nếp 16 SKG1 GN165 Viên NC Ngô Lào Ngô nếp 17 Khẩu Li GN166 Hầu Thào, Sa pa,Lào Cai Ngô nếp 18 Khâu Hù Khảo GN 173 Hoàng Su Phì, Hà Giang Ngô nếp 19 Nếp trắng GN237 Vị Xuyên, Hà Giang Ngô nếp 20 Ngô nếp VN2 (đ/C) VN2 Viện nghiên cứu ngô Ngô nếp 21 LCH9 (đ/C) LCH9 Viện nghiên cứu ngô Ngô tẻ
2. địa ựiểm và thời gian nghiên cứu
2.1. địa ựiểm: Vện Nghiên cứu Lúa, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 28
IỊ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
+ đánh giá sinh trưởng, phát triển và một số ựặc ựiểm nông sinh học, khả năng chống chịu của các mẫu giống
+ đánh giá khả năng chịu hạn của các mẫu giống trong ựiều kiện gây hạn nhân tạo trong chậu vại
+ đánh giá khả năng chịu hạn của các mẫu giống trong ựiều kiện gây hạn nhân tạo trong nhà có mái che
IIỊ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thắ nghiệm 1 : đánh giá ựặc ựiểm nông sinh học, năng suất, yếu tố tạo thành năng suất của các mẫu giống trong ựiều kiện ựồng ruộng theo K.ẠGomez, 1984 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Thời gian: Vụ Xuân năm 2012
+ địa ựiểm: Viện nghiên cứu Lúa trường đHNHN
+ Phương pháp bố trắ thắ nghiệm: Bố trắ thắ nghiệm khối hoàn toàn ngẫu nhiên (RCB) 3 lần lặp lại, diện tắch ô thắ nghiệm 10m2 . Theo dõi 20cây/ô
+ Kỹ thuật áp dụng
Làm ựất: cày bừa kỹ, nhặt sạch cỏ, san phẳng mặt ruộng, chia cụ thể các thắ nghiệm
Kỹ thuật gieo: Gieo hạt sâu 4-5cm, mỗi hốc 1 hạt. Khoảng cách hàng cách hàng 70cm, cây cách cây 30cm.
Bón phân: Lượng phân bón cho 1ha:
10 tấn phân chuồng + 90kg N + 120kg P2O5 + 90Kg KCl - Cách bón:
Bón lót: Toàn bộ phân chuồng + Lân + 1/3 đạm Bón thúc;
Lần 1: Khi ngô 3-5 lá bón 1/3 đạm + 1/2 Kali Lần 2: Khi ngô 7-9 lá bón 1/3 đạm + 1/2 Kali + Chăm sóc:
- Khi ngô 3-4 làm cỏ xới vun nhẹ quanh gốc kết hợp bón thúc lần 1; tiến hành dặm tỉạ
+ Tưới nước: Duy trì ựộ ẩm 70-80% sức giữ ẩm tối ựa ựồng ruộng, sau khi tưới nước, mưa phải thoát hết nước ựọng trong ruộng.
+ Phòng trừ sâu bệnh: Chỉ phun thuốc khi ựến ngưỡng phòng trừ theo hướng dẫn chung của nghành bảo vệ thực vật.
+ Thu hoạch: Khi chân hạt có vết ựen
+ Chỉ tiêu theo dõi
đánh giá tình hình sinh trưởng và phát triển của cây
+ Ngày gieo
+ Số ngày từ gieo ựến mọc + Số ngày từ gieo ựến 3-4 lá + Số ngày từ gieo ựến 7-9 lá + Số ngày từ gieo ựến xoắn nõn
+ Số ngày từ gieo ựến trỗ cờ khi quần thể có 70% số cây trỗ cờ tung phấn + Số ngày từ gieo ựến phun râu khi quần thể có 70% số cây phun râu
+ Ngày chắn (TGST): Khi chân hạt có chấm ựen hoặc có khoảng 75% số cây có lá bi khô.
Theo dõi ựánh giá một số tắnh trạng số lượng
+ Theo dõi ựộng thái tăng trưởng chiều cao cây 10 ngày 1 lần, ựo từ mặt ựất ựến ựỉnh lá cao nhất
+ Theo dõi ựộng thái ra lá, theo dõi 10 ngày 1 lần
+ Chiều cao cây cuối cùng (cm): đo từ gốc sát mặt ựất ựến ựỉnh cờ, ựược tắnh sau khi trỗ cờ 15 ngàỵ
+ Chiều cao ựóng bắp (cm): ựo từ gốc sát mặt ựất ựến mắt ựóng bắp trên cùng (bắp thứ nhất).
+ đường kắnh thân ( cm), ựo lóng thứ hai tắnh từ mặt ựất
+ Số lá: tắnh từ lá thật thứ nhất ựến cuối cùng, theo dõi bằng ựánh dấu sơn. + Diện tắch lá và chỉ số diện tắch lá các giai ựoạn 3-4 lá, 7-9 lá và thời kỳ trỗ
cờ phun râu
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 30 + Sâu ựục thân (%): đếm số cây có sâu ựục thân/ ô thắ nghiệm theo dõi ở giai
ựoạn 7-9 lá thật và giai ựoạn china sữa sau ựó tắnh tỷ lệ và cho ựiểm theo thang ựiểm: 1- < 5% số cây bị sâu 2- 5-<15% số cây bị sâu 3- 15-<25% số cây bị sâu 4- 25-<35% số cây bị sâu 5- > 35% số cây bị sâụ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Bệnh khô vằn, bệnh ựốm lá: Tắnh tỷ lệ và cho ựiểm từ 1-5 ựể xác ựịnh cấp ựộ bệnh theo thang ựiểm:
1. Không có lá bị bệnh 2. >5-15% diện tắch lá bị bệnh 3. >15-30% diện tắch lá bị bệnh 4. >30-50% diện tắch lá bị bệnh 5. > 50% diện tắch lá bị bệnh + Khả năng chống ựổ
Theo dõi tất cả các lần nhắc lại sau ựợt gió to và trước khi thu hoạch.
- đổ rễ (%): Tắnh phần trăm số cây bị ựổ nghiêng 1 góc >300 so với phương thẳng ựứng thì ựược coi là ựổ rễ.
- đổ gẫy thân: Tắnh phần trăm số cây bị gẫy ở ựoạn thân phắa dưới bắp trước khi thu hoạch.
đánh giá năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất:
+ Số bắp/ cây: Tổng số bắp/ ô chia cho tổng số cây/ ô. + Chiều dài bắp (cm): đo từ gốc bắp ựến ựầu múp bắp. + đường kắnh bắp (cm): đo ở vị trắ có ựường kắnh lớn nhất. + Số hàng hạt/ bắp.
+ Số hạt/ hàng.
+ Dạng hạt, màu sắt hạt và P1000 hạt (gam): để xác ựịnh khối lượng 1000 hạt, cân 2 mẫu mỗi mẫu 500 hạt, khối lượng giữa 2 lần chênh lệch nhau không quá 2 gam là chấp nhận ựược.
+ Năng suất cá thể : cân năng suất bắp tươi, bắp khô và hạt khô tất cả các cây
Thắ nghiệm 2: đánh giá khả năng chịu hạn bằng chậu vại
*đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của các dòng, giống ở giai ựoạn cây con bằng gây hạn nhân tạo trong chậu vại theo Lê Thị Muội (1998)
+ Thời gian: Vụ Xuân 2012
+ địa ựiểm: Trong nhà lưới có mái che viện Nghiên cứu Lúa
+ Phương pháp:
Mỗi giống ựược gieo vào 1 chậu cát sạch có ựục lỗ ở dưới ựáy với số lượng 30 hạt/chậụ
Thắ nghiệm ựược nhắc lại 3 lần.
Kỹ thuật chăm sóc bình thường khi cây con ựược 3 lá thì ngừng tưới nước ựể bắt ựầu gây hạn.
Phương pháp thu cây, theo dõi:
+ Theo dõi ựánh giá:
- Theo dõi ựánh giá mức ựộ cây không héo, ở các thời ựiểm sau 3, 5 và 7 ngày kể từ khi ngừng tướị
Số cây không héo Tỷ lệ cây không héo (%) =
Tổng số cây X 100
- Giống có tỷ lệ cây không héo cao thì có khả năng chịu hạn ở thời kỳ cây con - Sau 7 ngày gây hạn thì tưới nước trở lạị Theo dõi ựánh giá khả năng phục hồi cây sau 3, 5 và 7 ngày kể từ khi tưới trở lạị
Số cây phục hồi Tỷ lệ cây phục hồi =
Tổng số cây X 1000
Sau khi tưới trở lại, thì giống nào có tỷ lệ cây phục hồi cao thì có khả năng