2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2.2. Tổng hợp vật liệu tổ hợp cấu trỳc nano trờn nền polyme dẫn ứng dụng làm
dụng làm vật liệu cảm biến sinh học
2.2.2.1. Tổng hợp hạt nano Fe3O4
Khuấy đều dung dịch Fe2+ 0,35M và Fe3+ 0,70M trong 30 phỳt sau đú thờm NH4OH 10% với tốc độ 5-6 ml/phỳt trong mụi trường khớ N2. Tiếp tục khuấy hỗn hợp với tốc độ 400-500 vũng/phỳt trong 24 giờ. Tiến hành lọc rửa sản phẩm thu được rồi sấy khụ trong chõn khụng ở +700C.
2.2.2.2. Chế tạo điện cực
Cỏc vi điện cực được chế tạo bởi Viện Khoa học vật liệu, Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam trờn đế silic sử dụng phương phỏp quang khắc với cấu hỡnh 3 chõn: 1 cực làm việc và 1 cực đếm bằng Pt, 1 cực so sỏnh Ag/AgCl. Cấu tạo của cỏc điện cực đó chế tạo được mụ tả trong Hỡnh 2.1.
42
Hỡnh 2.1 Cấu tạo của điện cực (a) và hỡnh ảnh thực tế của điện cực (b) [70]
2.2.2.3. Trựng hợp điện húa màng Fe3O4/PPy
Màng Fe3O4/PPy được trựng hợp điện húa trờn vi điện cực được thực hiện trờn mỏy Autolab/PGSTAT sử dụng phương phỏp quột thế vũng (CV). Dung dịch điện phõn gồm monome pyrol 0,5M trong LiClO4 0,1M (pH=7) và Fe3O4 0,3% khối lượng (so với pyrrol) được rung siờu õm trong 30 phỳt. Tiến hành trựng hợp theo phương phỏp quột thế vũng (CV) trong khoảng thế từ -0.2V tới 0,9V, tốc độ quột 50mV/s, số chu kỳ quột là 20. Màng Fe3O4/PPy được rửa sạch với nước cất và bảo quản trong dung dịch PBS 50mM (pH=7).
2.2.2.4. Chế tạo màng Fe3O4/PANi/PSA
Trước hết, hạt sắt từ được tổng hợp bằng phương phỏp đồng kết tủa (như đó mụ tả ở 2.2.2.1). Sau đú, hạt nano Fe3O4 được cho vào 20ml dung dịch gồm styren, axit acrylic (tỉ lệ 1:1 theo thể tớch) sau đú cho thờm vào 200 ml nước. Phản ứng được thực hiện trong bỡnh cầu 3 cổ trong mụi trường khớ N2, tốc độ khuấy 700 vũng/phỳt, nhiệt độ phản ứng là 700C. Sau đú, thờm vào hỗn hợp 0,1 g (NH4)2S2O8 làm chất khơi mào phản ứng. Sau 1 giờ, nước và cỏc chất chưa phản ứng được loại bỏ bằng cỏch cụ quay chõn khụng thu được sản phẩm Fe3O4/poly(styren – axit acrylic) (Fe3O4/PSA) [90].
Hạt nano Fe3O4/PSA hoạt húa bằng cỏch phõn tỏn trong dung dịch PBS cú chứa EDC (10 mM) và NHS (10 mM). Sau đú, thu hạt nano Fe3O4/PSA bằng nam chõm và rửa bằng dung dịch PBS để loại bỏ EDC và NHS dư. Cuối cựng, hạt nano
43
Fe3O4/PSA đó được xử lớ với EDC/NHS sẽ được đưa vào dung dịch chứa CHOx (4 U ml-1) tạo thành nano Fe3O4/PSA/ChOx
2.2.2.5. Chế tạo cảm biến glucose và cholesterol
. * Húa chất và dụng cụ
- Enzym Glucose (GOx, E.C.1.1.3.4, 20kU, Sigma-Aldrich) được tỏch từ nấm
Aspergillus niger.
- Enzym Cholesterol (ChOx, E.C.1.1.3.6, ≥50 units/mg, Sigma-Aldrich) được tỏch từ Brevibacterium.
- Dung dịch Glutaraldehyde dạng hơi bóo hũa 25% (Sigma-Aldrich).
- Dung dịch đệm muối phosphat gốc 0,1M (PBS 10x) là hỗn hợp gồm cú NaCl 1,37M + 0,027M KCl + 0,08M Na2HPO4 + 0,02M KH2PO4.
- K3[Fe(CN)6] 0,1M
- Mỏy đo pH, micropipet và cỏc dụng cụ cần thiết khỏc.
* Chế tạo cảm biến glucose
Điện cực cú màng nano Fe3O4/PPy được ủ trong dung dịch glutaraldehyde 25% trong 1 giờ, sau đú làm khụ trong khụng khớ ở nhiệt độ thường. Lấy 5μl dung dịch enzym GOx 3mg/ml được pha trong đệm PBS tiến hành nhỏ phủ (drip coating) lờn bề mặt màng và ủ ở 4oC trong ớt nhất 24 giờ. Điện cực sau khi cố định enzym được rửa bằng dung dịch đệm PBS 20mM (pH=7) để loại bỏ glutaraldehyde dư và cỏc enzym khụng được cố định vào màng. Bảo quản điện cực trong dung dịch đệm PBS 50mM (pH=7) ở 4oC.
* Chế tạo cảm biến cholesterol
Màng PANi được trựng hợp điện húa trờn vi điện cực (mục 2.2.2.2) thực hiện trờn mỏy Autolab/PGSTAT sử dụng phương phỏp quột thế vũng (CV). Dung dịch điện phõn gồm monome anilin 0,05M trong HCl 0,5M. Tiến hành trựng hợp theo phương phỏp quột thế vũng (CV) trong khoảng thế từ -0.2V tới +1,0V, tốc độ quột 50mV/s, số chu kỳ quột là 20. Màng Pt/PANi được rửa sạch với dung dịch PBS 50mM (pH=7) sau đú được ủ trong dung dịch glutaraldehyde 25% trong 1 giờ.
Lấy 20àl nano Fe3O4/PSA/ChOx nhỏ phủ lờn điện cực chứa màng Pt/PANi và để khụ trong 8 giờ. Sau đú rửa bằng dung dịch đệm PBS 20mM (pH=7), và nước khử
44
ion để loại bỏ cỏc enzym khụng được cố định. Bảo quản điện cực trong dung dịch đệm PBS 20mM ở 4oC.
Sơ đồ quỏ trỡnh cố định enzym theo phương phỏp liờn kết chộo sử dụng tỏc nhõn glutaraldehyde được thể hiện trong Hỡnh 2.2.
Hỡnh 2.2 Sơ đồ quỏ trỡnh cố định enzym theo phương phỏp liờn kết chộo sử dụng tỏc nhõn glutaraldehyde