BOX-PCR
Kết quả phân tích sản phẩm khuếch đại bằng phản ứng BOX-PCR trên gel agarose với nồng độ 1,5% cho thấy kích thước của các đoạn DNA hiện diện giữa các tiểu đoạn boxA ở 6 dòng vi khuẩn là giống nhau (Hình 18), với các đoạn được khuếch đại chính có kích thước khoảng 300, 390, 420, 500, 950 và 1750bp. Nhằm tiếp tục khảo sát sự khác biệt của các trình tự nằm giữa các tiểu đoạn boxA, sản phẩm khuếch đại được phân cắt bằng 2 enzyme cắt giới hạn AluI và MboI. Trình tự nhận biết của từng enzyme và thành phần phản ứng cắt enzyme được trình bày ở Phụ lục 2.
Hình 18. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại bởi cặp mồi BOXA1R
Chú thích: M1 và M2: thang chuẩn Fermentas 100bp plus; 1: PT10; 2: NT4; 3: TV2B3; 4: AM3; 5: CT14; 6: TN4
Kết quả phân cắt sản phẩm BOX-PCR bằng 2 enzyme AluI và MboI cho thấy các vùng gen giữa các tiểu đoạn boxA có bao gồm trình tự nhận biết của các enzyme này, các đoạn sản phẩm khuếch đại có kích thước lớn hơn 400bp đã bị phân cắt thành các đoạn DNA kích thước nhỏ hơn. Tuy nhiên, phổ điện di của 6 dòng vi khuẩn vẫn bao gồm các đoạn DNA có kích thước giống nhau trong cả 2 trường hợp (Hình 19).
1000bp
500bp
Hình 19. Kết quả phân cắt vùng gen giữa các tiểu đoạn boxA với enzyme AluI (trái) và enzyme MboI
Chú thích: M1 và M2: thang chuẩn Fermentas 100bp plus; 1: PT10; 2: NT4; 3: TV2B3; 4: AM3; 5: CT14; 6: TN4
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
- Tất cả các dòng vi khuẩn được khảo sát đều có khả năng hòa tan lân khó tan, trong đó, dòng TV2B3 là dòng có khả năng hòa tan lân tốt nhất.
- Khi được chủng vào môi trường không bổ sung tryptophan, 12/18 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA vào ngày 6 hoặc 8 sau khi chủng, hàm lượng IAA sinh ra rất thấp.
- 6/18 dòng vi khuẩn thể hiện khả năng tổng hợp enzyme chitinase và đối kháng nấm
P. oryzae trong điều kiện in vitro: CT14, AM3, TV2B3, PT10, NT4 và TN4. Trong đó, 2 dòng vi khuẩn CT14 và AM3 là 2 dòng có tính đối kháng mạnh nhất.
- Chưa tìm thấy sự khác biệt về mặt di truyền của 6 dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng nấm khi tiến hành phân tích bộ gen của chúng bằng kỹ thuật BOX-PCR.
5.2. Đề nghị
Tiếp tục khảo sát khác biệt di truyền của các dòng vi khuẩn CT14, AM3, TV2B3, PT10, NT4 và TN4 bằng các kỹ thuật sinh học phân tử khác (giải trình tự, Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP),...) nhằm kiểm tra tính chính xác của kỹ thuật BOX-PCR.
Kiểm tra khả năng phòng trừ bệnh đạo ôn lúa của 2 dòng vi khuẩn CT14 và AM3 trong các thí nghiệm trong nhà lưới và ngoài đồng nhằm khảo sát khả năng ứng dụng 2 dòng vi khuẩn này dưới dạng chế phẩm vi sinh.
Định danh 02 dòng vi khuẩn CT14 và AM3 nhằm phục vụ thông tin cho các nghiên cứu ứng dụng vào thực tiễn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. 2012. Báo cáo tổng kết thực hiện kế hoạch năm
2012 và triển khai nhiệm vụ kế hoạch năm 2013.
Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành. 2010. Giáo trình Nấm học. Nxb. Đại học Cần Thơ,
trang 98-100.
Cao Ngọc Điệp và Phan Thị Nhã. 2011. Phân lập và xác định đặc tính vi khuẩn nội sinh trong
cây khóm (Ananas cosmosus L.) trồng trên đất phèn thị xã Vị Thanh, tỉnh Hậu Giang.
Tạp chí Công nghệ Sinh học, 9(2):243-250.
Cao Ngọc Điệp. 2011. Sách chuyên khảo Vi khuẩn nội sinh thực vật (Endophytic bacteria).
Nxb. Đại học Cần Thơ, trang 64-65.
Dương Thị Kim Loan. 2009. Khả năng cố định đạm tự do trên đất phù sa và đất phèn trồng
lúa. Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học
Cần Thơ.
Đặng Thị Thùy Vân. 2013. Phân lập và nhận diện vi khuẩn Bacillus sp. đối kháng nấm
Pyricularia oryzae L. từ đất và cây lúa cao sản trồng ở Đồng bằng sông Cửu Long.
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
Đỗ Thị Trường. 2000. Vi Khuẩn lam cố định Nitơ trên đất trồng Lúa ở huyện Hòa Vang –
Thành phố Đà Nẵng. Thông Báo Khoa Học, 3:36-39.
Lăng Ngọc Dậu. 2006. Đánh giá khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA của vi
khuẩn sống trong rễ và thân lúa mùa đặc sản ở Đồng bằng Sông Cửu Long. Luận văn tốt
nghiệp thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
Lê Thị Hiền Thảo. 2011. Nitơ và Phospho trong môi truờng. Trường Đại Học Xây Dựng.
Lê Xuân Phương. 2001. Vi sinh vật công nghiệp. Nxb. Hà Nội.
Ngô Thanh Phong, Nguyễn Thị Minh Thư và Cao Ngọc Điệp. 2010. Phân lập và nhận diện vi
khuẩn cố định đạm trong đất vùng rễ lúa trồng trên đất phù sa tỉnh Kiên Giang. Tạp chí
Công nghệ Sinh học, 8(3A):1015-1020.
Nguyễn Bá Hữu và Đặng Thị Cẩm Hà. 2007. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học phân tử của ba chủng vi khuẩn sử dụng 2,4-D phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ chứa Dioxin tại
Đà Nẵng. Tạp chí Sinh học, 29(4):80-85.
Nguyễn Đức Lượng. 1996. Vi sinh vật học. Nxb. Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh.
Nguyễn Ngọc Đệ. 2008. Giáo trình cây lúa. Nxb. Đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh,
Nguyễn Thị Phi Oanh, Hứa Văn Ủ và Dirk Springael. 2011. Vi khuẩn phân hủy 2,4-D trong
đất lúa ở Tiền Giang và Sóc Trăng. Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ, 18a:65-70.
Nguyễn Thị Phương Oanh, Trần Bửu Minh, Nguyễn Ngọc Trâm, Lý Thành Nghĩa. 2012. Khảo sát ảnh hưởng của một số dòng vi khuẩn vùng rễ lên sự phát triển của giống lúa
OM3536 trong điều kiện in vitro. Đề tài khoa học công nghệ cấp Trường năm 2012,
Trường Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Thị Phương Thảo, Ngô Thanh Phong và Cao Ngọc Điệp. 2011. Phân lập và nhận diện vi khuẩn cố định đạm trong đất vùng rễ lúa trồng trên đất phù sa tỉnh Vĩnh Long.
Tạp chí Công nghệ Sinh học, 9(4):521-528.
Nguyễn Trần Minh Đức. 2013. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn vùng rễ lúa thuộc đất nhiễm
mặn có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA. Luận văn tốt nghiệp đại học ngành
Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ.
Phạm Thị Ánh Loan. 2012. Phân lập một số dòng Pseudomonas trong vùng rễ có khả năng
tổng hợp kích thích tố tăng trưởng và ứng dụng trên cây lúa. Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ
ngành Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ.
Phùng Văn Tạo. 2013. Phân lập, khảo sát đặc tính và nhận diện một số dòng vi khuẩn nội sinh
ở cây mè. Luận văn tốt nghiệp cao học ngành Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ.
Trần Thanh Phong và Cao Ngọc Điệp. 2011. Phân lập và xác định đặc tính vi khuẩn nội sinh
trong cây khóm (Ananas cosmosus L.) trồng trên đất phèn huyện Tân Phước, tỉnh Tiền
Giang. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 9(1):125-132.
Tiếng Anh
Alagawadi, A.R. and A.C. Gaur. 1988. Associative effect of Rhizobium and phosphate
solubilizing bacteria on the yield and nutrient uptake of chickpea. Plant and Soil,
105:241-246.
Antoun, H. and D. Prévost. 2005. Ecology of Plant Growth-Promoting Rhizobacteria. In
PGPR: Biocontrol and Biofertilization, ed. Z.A, Siddiqui, Springer, pp.1-38.
Barriuso, J., B.R. Solano, J.A. Lucas, A.P. Lobo, A. García-Villaraco and F.J.G Manero. 2008. Ecology, genetic diversity and screening strategies of Plant Growth-promoting
Rhizobacteria (PGPR). In Plant-bacteria interactions: Strategies and techniques to
promote plant growth, ed. I. Admad, J. Pichtel and S. Hayat, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, pp.1-17.
Cattenlla, A.J., P.G. Hartel and J.J Fuhrmann. 1999. Screening for plant growth-promoting
rhizobacteria to promote early soybean growth. Soil Science Society of America,
Currie, B.J., D. Gal, M. Mayo, L. Ward, D. Godoy, B.G. Spratt and J.J. LiPuma. 2007. Using
BOX-PCR to exclude a clonal outbreak of melioidosis. BMC Infectious Diseases.
Chan, Y., W.L. Barraquio and R. Knowles. 1994. N2-fixing Pseudomonas and related soil
bacteria. FEMS Microbiology Reviews, 13:95-118.
Chung, H., M. Park, M. Madhaiyan, S. Seshadri, J. Song, H. Cho and T. Sa. 2005. Isolation and characterization of phosphate solubilizing bacteria from the rhizosphere of crop
plants of Korea. Soil Biology & Biochemistry, 37:1970-1974.
Dobbelaere, S., Vanderleyden, J. and Okon, Y., 2003. Plant growth-promoting effects of
diazotrophs in the rhizosphere, Critical Reviews in Plant Science, 22:107-149.
Foster, R.C., A.D. Rovira and T.W. Cock. 1983. Ultrastructure of the Root-Soil Interface. The
American Phytopathological Society, St. Paul, MN., pp.157.
Fridlender, M., J. Inbar and I. Chet. 1993. Biological control of soilborne plant pathogens by a
β-1,3-glucanase-producing Pseudomonas cepacia. Soil Biology & Biochemistry,
25:1211-1221.
Fuentes-Ramirez, L.E. and J. Caballero-Mellado. 2005. Bacteria fertilizer. In PGPR:
Biocontrol and Biofertilization, ed. Z.A, Siddiqui, Springer, pp.143-172.
Goldstein, A.H. 1994. Involvement of the quinoprotein glucose dehydrogenase in the
solubilization of exogenous phosphates by Gram-negative bacteria. In Phosphate in
Microorganisms: Cellular and Molecular Biology, ed. A. Torriani-Gorini, E. Yagil, S. Silver, ASM Press, Washington DC, pp.197-203.
Gopalakrishnan, S., P. Humayun, B.K. Kiran, I.G.K. Kannan, M.S. Vidya, K. Deepthi and O. Rupela. 2010. Evaluation of bacteria isolated from rice rhizosphere for biological
control of charcoal rot of sorghum caused by Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid..
World Journal of Microbiological Biotechnology.
Gray, E.J. and D.L. Smith. 2005. Intracellular and extracellular PGPR: Commonalities and
distinction in the plant-bacterium signaling processes. Soil Biology & Biochemistry,
37:395-412.
Gyaneshwar, P., E.K. Janes, N. Mathan, P.M. Reddy, B. Reinhold-Hweh and J.K. Ladha.
2002. Endophytic colonization of rice by adiazothropic strain of Serratia marcescens.
Journal of Bacteriology, 183:2634-2643.
Han, H.S., Supanjani and K.D., Lee. 2006. Effect of co-inoculation with phosphate and potassium solubilizing bacteria on mineral uptake and growth of pepper and cucumber.
Plant Soil and Environment, 52(3):130-136.
Harari, A., J. Kigel and Y. Okon. 1988. Involvement of IAA in the interaction between
Hariprasad, P. and S.R. Niranjana. 2009. Isolation and characterization of phosphate
solubilizing rhizobacteria to improve plant health of tomato. Plant and Soil, 316:13-24.
Kamil, Z., M. Rizk, M. Saleh and S. Moustafa. 2007. Isolation and identification of
rhizosphere soil chitinolytic bacteria and their potential in antifungal biocontrol. Global
Journal of Molecular Sciences, 2(2):57-66.
Kapulnik, Y., Y. Okon and Y. Henis. 1985. Changes in root morphology of wheat caused by
Azospirillum inoculation. Canadian Journal of Microbiology, 31:881-887.
Karnwal, A. 2009. Production of Indole acetic acid by Pseudomonas fluorescens in the presence
of L-tryptophan and rice root exudates. Journal of Plant Pathology, 91(1):61-63.
Kaushik, B.D., A.K. Saxena and R. Prasanna. 2004. Techniques in Microbiology: A Laboratory Manual for Post Graduate students. Publs. Director IARI. ISBN:81- 88708-02-X
Kaymak, H.C., F. Yarali, I. Guvenc and M.F. Donmez. 2008. The effect of inoculation with
plant growth-promoting Rhizobacteria (PGPR) on root formation of mint (Mentha
piperita L.) cuttings. African Journal of Biotechnology, 7(24):4479-4483.
Kloepper, J.W., R. Lifshitz and R.M. Zablotowics. 1989. Free-living bacterial inocula for
enhancing crop productivity. Trends in Biotechnology, 7(2):39-44.
Kloepper, J.W., R. Rodriguez-Ubana, G.W. Zehnder, J.F. Murphy, E. Sikora and C. Fernandez. 1999. Plant root-bacterial interactions in biological control of soilborne
diseases and potential extension to systemic and foliar diseases. Australasian Plant
Pathology, 28:21-26.
Kloepper, J.W., S. Tuzun, L. Liu and G. Wei. 1993. Plant growth-promoting rhizobacteria as
inducers of systemic disease resistance. In Pest Management: Biologically Based
Technologies, ed. R.D Lumsden and J. Waughn, pp.156-165, Washington, DC: American Chemical Society Books.
Koeuth, T., J. Versalovic and J.R., Lupski. 1995. Differential subsequence conservation of
interspersed repetitive Streptococcus pneumoniae BOX elements in diverse bacteria.
Genome Research, 5:408-418.
Khalid, A., S. Tahir, M. Arshad and Z.A. Zahir. 2004. Relative efficiency of rhizobacteria for
auxin biosynthesis in rhizosphere and non-rhizosphere soils. Aus J Soil Res, 42:921-926.
Lambert, B. and J. Joos. 1989. Fundamental aspects of rhizobacterial plant growth promotion
Lim, H.S., Y.S. Kim and S.D. Kim. 1991. Pseudomonas stutzeri YPL-1 genetic
transformation and antifungal mechanism against Fusarium solani, an agent of plant
root rot. Applied and Environmental Microbiology, 57:510-516.
Lisek, A., L. S. Paszt, M. Oskiera, P. Trzciński, A. Bogumił, A. Kulisiewicz and E. Malusá.
Use of the rep-PCR technique for differentiating isolates of rhizobacteria. Journal of
Fruit and Ornamental Plant Research, 19(1):5-12.
Louden, B.C., D. Haarmann and A.M. Lynne. 2011. Use of blue agar CAS assay for
siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education, 12(1).
Lupski, J.R. and G.M. Weinstock. 1992. Short, interspersed repetitive DNA sequences in
prokaryotic genomes. Journal of bacteriology, 174(14):4525-4529.
Martínez-Viveros, O., M.A. Jorquera, D.E Crowley, G. Gajardo and M.L. Mora. 2010. Mechanisms and practical considerations involved in plant growth promotion by
rhizobacteria. Journal of Soil Science and Plant Nutrition, 10(3):293-319.
Moran, L.A., H.R. Horton, K.G. Scringeour and M.D. Perry. In Principle of Biochemistry, ed.
A. Jaworski, Pearson, pp.515-516.
Nelson, W.O.V. 2007. A review on beneficial effects of rhizosphere bacteria on soil nutrient
availability and plant nutrient uptake. Rev. Fac. Nal. Agr. Medellín, 60(1):3621-3643.
Noori, M.S.S. and H.M. Saud. 2012. Potential plant growth-promoting activity of
Pseudomonas sp. isolated from paddy soil in Malaysia as biocontrol agent. Plants Pathology & Microbiology, 3(2).
Oliveira, C.A., V.M.C. Alves, I.E. Marriel, E.A. Gomes, M.R. Scotti, N.P. Carneiro, C.T. Guimarães, R.E. Schaffert and N.M.H. Sá. 2009. Phosphate solubilizing microorganisms isolated from rhizosphere of maize cultivated in an oxisol of the
Brazilian Cerrado Biome. Soil Biology & Biochemistry, 41:1782-1787.
Oliveira, F.L, E.M. Ferreira and M.E. Pampulha. 1997. Nitrogen fixation, nodulation and
yield of clover plants co-inoculated with root-colonizing bacteria. Symbiosis, 23:35-42.
Ordentlich, A., Y. Elad and I. Chet. 1988. The role of chitinase of Serratia marcescens in
biocontrol of Sclerotium rolfsii. Phytopathology, 78:84-88.
Patten, C.L. and B.R. Glick. 1996. Bacterial biosynthesis of indole-3-acetic acid. Canadian J
Microbiol, 42:207-220.
Prithiviraj, B., X. Zhou, A. Souleimanov, W.M. Kahn and D.L. Smith. 2003. A host-specific bacteria-to-plant signal molecule (Nod factor) enhances germination and early growth of
diverse crop plants. Planta, 21:437-445.
Ramyasmruthi, S., O. Pallavi, S. Pallavi, K. Tilak and S. Srividya. 2012. Chitinolytic and
rhizosphere effective against broad spectrum fungal phytopathogens. Asian Journal of Plant Science and Research, 2(1):16-24.
Saharan, B.S. and V. Nehra. 2011. Plant Growth-promoting Rhizobacteria: A Critical Review.
Life Sciences and Medicine Research, 21:1-30.
Shahab, S., N. Ahmed and N.S. Khan. 2009. Indole acetic acid production and enhanced plant
growth promotion by indigenous PSBs. African Journal of Agricultural Research,
4(11):1312-1316.
Shyamala, L. and P.K.Sivakumaar. 2012. Antifungal activity of rhizobacteria isolated from
rice rhizosphere soil against rice blast fungus Pyricularia oryzae. International Journal
of Pharmaceutical & Biological Archives, 3(3):692- 696.
Spaepen, S. and J. Vanderleyden. 2010. Auxin and Plant-Microbe Interactions. Cold Spring
Harbor Perspective in Biology, 10:1-13.
Spaepen, S., J. Vanderleyden and R. Remans. 2007. Indole-3-acetic acid in microbial and microorganism-plant signaling. Federation of European Microbiological Societies Microbiol Review, 31: 425–448.
Steenhoudt, O. and J. Vanderleyden. 2000. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing
bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects.
FEMS Microbiology Reviews, 24:487-506.
Steenhout, O. and J. Vanderlayden. 2000. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing
bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects.
Federation of European Microbiological Societies, 24:487-506.
Supanjani, H.S Han, J.S Jung, and K.D. Lee. 2006. Rock phosphate-potassium and rock-
solubilising bacteria as alternative, sustainable fertilisers. Agronomy for Sustainable
Development, 26(4):233-240.
Tien, T.M., M.H Gaskins and D.H. Hubbell. 1979. Plant growth substances produced by
Azospirillum brasilense and their effect on the growth of pearl millet (Pennisetum americanum L.), Applied and Environmental Microbiology, 37:1016-1024.
Versalovic, J., T. Koeuth and J.R. Lupski. 1991. Distribution of repetitive DNAsequences in
eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids
Research, 19(24):6823-6831.
Zaim, S., L. Belabid and M. Bellahcene. 2013. Biocontrol of chickpea Fusarium wilt by
Bacillus spp. Rhizobacteria. Journal of Plant Protection Research, 53(2):177-183. Zehnder, G.W., J.F. Murphy, E.J Sikora and J.W. Kloepper. 2001. Application of
Trang web http://en.wikipedia.org/wiki/Azospirillum: (ngày 14/08/2012) http://en.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas: (ngày 14/08/2012) http://www.answersingenesis.org/articles/aid/v6/n1/serratia-marcescens-miracle-bacteria: (ngày 22/02/2013) http://www.dpi.nsw.gov.au/_data/assets/pdf_file/0004/.../Rhizosphere.pdf: (ngày 07/06/2013) http://www.forestryimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=1570118: (ngày 05/8/2013) http://www.lsuagcenter.com/en/crops_livestock/crops/rice/Diseases/photos/sheath_blight/SB+ 1.htm: (ngày 15/8/2013) http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0929139311002551: (ngày 22/02/2013) http://www.sggp.org.vn/nongnghiepkt/2012/11/304535: (ngày 07/02/2013) http://www.sites.google.com/site/azotobacterwebsite/nutritional-requirements: (ngày 14/08/2012) http://www.vaas.org.vn/images/caylua/10/069_benhdaoon.htm: (ngày 22/02/2013) http://www.vast.ac.vn/1.0/index.php?option=com_content&view=article&id=1387%3Anghie n-cu-va-s-dng-ch-phm-sinh-hc-t-vi-khun-i-khang-kim-soat-nm-hi-cay-trng&catid=27%3