Định tính khả năng hòa tan lân trên môi trường có chứa lân khó tan – môi trường NBRIP đặc (Nautiyal, 1999):
- Nguyên tắc: Khi được chủng trên môi trường NBRIP, những dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân sẽ phát triển và hình thành khuẩn lạc, tạo ra vòng sáng đồng tâm trong suốt quanh khuẩn lạc và/hoặc làm thay đổi màu sắc của môi trường dựa trên sự thay đổi pH (do sự đổi màu của chất chỉ thị Bromophenol blue - BPB). Dựa trên sự hình thành vòng sáng hòa tan, khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn được đánh giá bước đầu thông qua chỉ số hòa tan lân (PSI).
- Phương pháp thực hiện:
Chuẩn bị vi khuẩn gốc: dùng que cấy lấy một phần sinh khối vi khuẩn cho vào ống nghiệm có chứa 3 mL môi trường Burk’s không đạm lỏng (khi lấy mẫu cần lấy đầy vòng tròn của đầu que cấy để đảm bảo lượng vi khuẩn được chủng vào môi trường tương đối đều nhau), ủ trên máy lắc ở điều kiện tối trong 3 ngày để vi khuẩn đạt đến mật số khoảng 107.
Sử dụng phương pháp nhỏ giọt để kiểm tra khả năng hòa tan lân trên môi trường NBRIP đặc: Chia đĩa môi trường thành 4 vùng bằng nhau, mỗi vùng chủng 4 µL dịch vi khuẩn gốc, để những giọt dung dịch này khô hẳn (thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng), sau đó ủ ở 30ºC trong 5 ngày. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần cho từng dòng vi khuẩn.
Tiến hành đo đường kính của vi khuẩn và đường kính của vòng sáng đo vi khuẩn tạo thành từ đó tính được chỉ số hòa tan lân (PSI).
Công thức tính chỉ số PSI:
PSI = (d(khuẩn lạc) + d(vòng sáng))/d(khuẩn lạc)
Trong đó: d: Đường kính
Định lượng lân hoà tan sinh ra bằng phương pháp Ascorbic acid (Kaushik et
al., 2004):
- Nguyên tắc: Trong phương pháp Ascorbic acid, thuốc thử Ascorbic acid – Ammoniummolypdate – Potassium antymonyl tartrate được sử dụng để xác định lượng lân hoà tan tạo ra trong dung dịch dựa trên các phản ứng sau:
Lân hoà tan trong môi trường tác dụng với Ammoniummolypdate trong môi trường acid tạo thành hợp chất phosphomolypdate màu vàng:
H2PO4- + NH4+ + MoO42+ + 2H2+ (NH4)3[P(MoO10)4]
Với sự hiện diện của chất khử (Ascorbic acid), Mo6+ bị khử thành Mo3+ hoặc Mo2+ làm cho dung dịch chuyển sang màu xanh. Cường độ màu xanh thay đổi theo hàm lượng lân hoà tan có trong dịch nuôi vi khuẩn, pH, điều kiện khử của môi trường và được xác định bằng phương pháp so màu Oniani ở bước sóng 880 nm. Trong môi trường có nồng độ acid thích hợp, dư molypdate và lượng chất khử cố định thì mật độ quang học (OD) của dịch mẫu sau phản ứng với thuốc thử tỉ lệ với hàm lượng lân hoà tan.
Phương pháp thực hiện:
Chuẩn bị dịch vi khuẩn: Chủng 200 L dịch vi khuẩn gốc (chuẩn bị ở phần định tính khả năng hòa tan lân) vào ống nghiệm có chứa 6 mL môi trường NBRIP lỏng, ủ trên máy lắc (120 vòng/phút), thí nghiệm lặp lại 3 lần cho 1 dòng vi khuẩn.
Xây dựng đường chuẩn P2O5: chuẩn bị dãy 6 ống nghiệm, đánh số thứ tự 0-1-2- 3-4-5 tương ứng với nồng độ P2O5 trong ống, lần lượt thêm vào mỗi ống nghiệm các thành phần trình bày trong Bảng 2, trộn đều bằng máy khuấy, ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 20 phút để phản ứng tạo màu xảy ra, nồng độ P2O5 càng cao thì màu xanh càng đậm. Ống số 0 được sử dụng làm đối chứng âm.
Bảng 7. Thành phần dãy đường chuẩn P2O5
Ống nghiệm
Thành phần 0 1 2 3 4 5
Nước cất (mL) 5 5 5 5 5 5
Dung dịch lân chuẩn 10ppm (mL) 0 0,5 1 1,5 2 2,5
Dung dịch B (mL) 4 4 4 4 4 4
Nước cất (mL) 3,5 3 2,5 2 1,5 1
Chuẩn bị mẫu vi khuẩn: Hàm lượng lân hoà tan trong dịch nuôi vi khuẩn được khảo sát tại các thời điểm 5, 10 và 15 ngày sau khi chủng vi khuẩn vào môi trường NBRIP. Ly tâm 1 mL dịch vi khuẩn ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 5 phút. Chuyển 0,5 mL dịch sau ly tâm sang ống nghiệm chứa 5 mL nước cất khử trùng, thêm 4 mL dung dịch B và 3 mL vào mỗi ống mẫu, trộn đều dung dịch bằng máy khuấy. Để ổn định 20 phút ở nhiệt độ phòng và tiến hành đo lượng lân hoà tan bằng phương pháp so màu Oniani ở bước sóng 880 nm (OD880nm).
Từ kết quả đo OD của đường chuẩn dùng chương trình vẽ đồ thị trong phần mềm Excel để xác định phương trình đường chuẩn P2O5. Thay kết quả OD của các mẫu vào phương trình đồ thị đường chuẩn từ đó tính được hàm lượng lân hoà tan trong dịch vi khuẩn.