1995)
Nguyên tắc: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn (nuôi tăng sinh trong
phương pháp so màu ở bước sóng 530 nm. Trong phương pháp này, sự hiện diện của IAA trong dịch vi khuẩn được nhận biết bằng sự xuất hiện của màu hồng khi cho dịch vi khuẩn phản ứng với thuốc thử Salkowsky (R2), hàm lượng IAA càng cao thì màu hồng sinh ra càng đậm.
Phương pháp thực hiện:
Chuẩn bị hóa chất:
- Thuốc thử R2: Chuẩn bị dung dịch H2SO4 10,8M (553 mL H2SO4+447 mL nước cất), thêm 4,5 g FeCl3 vào 1 lít dung dịch H2SO4 10,8M, khuấy đều đến khi thu được dung dịch đồng nhất, bảo quản trong chai thủy tinh sậm màu (Cao Ngọc Điệp, 2010).
- Đệm phosphate:
Dung dịch A: 0,136 g KH2PO4 trong 100 mL nước cất
Dung dịch B: 0,174 g K2HPO4 trong 100 mL nước cất
Pha 2 dung dịch A và B theo tỉ lệ 39 mL dung dịch A và 61 mL dung dịch B, cho nước cất vào đến đủ 200 mL.
- Dung dịch IAA chuẩn: pha dung dịch IAA chuẩn có nồng độ gốc 160 µg/mL, khi tiến hành dựng đường chuẩn, pha loãng dung dịch IAA bằng đệm phosphate để thu được các dung dịch chuẩn có nồng độ IAA lần lượt là 80, 40, 20, 10, 5 và 2,5 µg/mL. Trong quá trình pha loãng IAA và dựng đường chuẩn cần hạn chế sáng để tránh IAA bị phân hủy làm sai lệch kết quả thí nghiệm.
Chuẩn bị vi khuẩn gốc:
- Nhân sinh khối các dòng vi khuẩn được chọn trong các ống nghiệm chứa 3 mL môi trường Burk’s lỏng không đạm, đặt trên máy lắc ở nhiệt độ phòng ở điều kiện tối trong 3 ngày.
- Chuyển 150 L dịch tăng sinh vi khuẩn (mật số 107) sang ống nghiệm chứa 1,5 mL môi trường Burk’s không đạm, ủ lắc trong điều kiện tối. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn ở các ngày 2, 4, 6, 8 sau khi chủng. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần/dòng vi khuẩn cho từng ngày đo.
Xây dựng đường chuẩn IAA:
Các dung dịch chuẩn IAA với hàm lượng từ 2,5 đến 80 µg/mL lần lượt được cho vào các ống nghiệm đánh số từ 1 đến 6 đã cho sẵn 2ml thuốc thử R2, riêng ống 0 được
cho vào 2 mL thuốc thử R2+1 mL đệm phosphate. Lắc đều các ống nghiệm, để trong tối ở nhiệt độ phòng khoảng 15-30 phút để phản ứng tạo màu xảy ra.
Hình 8. Đường chuẩn IAA với nồng độ từ 0-80 µg/mL
Xác định hàm lượng IAA có trong mẫu vi khuẩn:
Ly tâm lạnh ở 4ºC 2 mL dịch vi khuẩn với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 4 phút để loại bỏ tế bào. Hút 1 mL phần dịch trong sau khi ly tâm cho vào các ống nghiệm đã chứa sẵn 2 mL thuốc thử R2, trộn đều dung dịch. Để ổn định ở nhiệt độ phòng khoảng 15-30 phút trong điều kiện tối để phản ứng tạo màu xảy ra.
Đo hàm lượng IAA:
- Bật máy quang phổ khoảng 30 phút trước khi đo, hàm lượng IAA được xác định bằng cách đo mật độ quang học của dung dịch ở bước sóng 530nm (OD530nm).
- Sử dụng giá trị đo OD của ống 0 (không có IAA, không có màu hồng) làm mẫu đối chứng âm, đưa giá trị OD về 0 (blank) để tiến hành đo giá trị OD của 6 ống còn lại trong dãy đường chuẩn. Bảy ống nghiệm 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 lần lượt có màu hồng đậm dần tương ứng với giá trị OD tăng dần tỉ lệ với hàm lượng IAA có trong dung dịch.
- Từ kết quả đo OD của đường chuẩn dùng chương trình vẽ đồ thị trong phần mềm Excel để xác định phương trình đường chuẩn IAA. Thay kết quả OD của các dòng vi khuẩn phân lập được vào phương trình đồ thị đường chuẩn từ đó tính được hàm lượng IAA trong dịch vi khuẩn.