Thí nghiệm 5: Khảo sát sự khác biệt di truyền của các dòng vi khuẩn có

khả năng tổng hợp chitinase bằng kỹ thuật BOX-PCR

 Trích DNA vi khuẩn: Nuôi vi khuẩn trong 4 mL môi trường LB lỏng, đặt trên máy lắc trong 72 giờ ở nhiệt độ 30C để tăng sinh khối. Khi sinh khối vi khuẩn đạt yêu cầu, thực hiện các bước trích DNA (Wilson et al., 1992) như sau:

- Chuyển 4mL dịch vi khuẩn nuôi trong LB sang 2 eppendorf 2 mL, 2 mL/eppendorf.

- Ly tâm dịch vi khuẩn ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5 phút.

- Hòa tan sinh khối thu được sau ly tâm bằng 250 µL dung dịch TE (pH 8), dồn mẫu ở 2 eppendorf vào 1 eppendorf 2 mL.

- Thêm 50 µL SDS 10% để phá màng tế bào, giải phóng DNA ra môi trường trích.

- Thêm 5 µL proteinase K để phá vỡ màng tế bào, giải phóng DNA ra môi trường, đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.

- Ủ ở nhiệt độ 65ºC trong 20 phút, 5 phút đảo ngược eppendorf một lần.

- Thêm vào 400 µL CTAB 10% có chứa NaCl 0,7M.

- Ủ ở nhiệt độ 65ºC trong 20 phút.

- Thêm vào 600 µL chloroform:isoamyl alcohol (24:1) để tách chloroform và DNA, protein tạo màng ngăn giữa DNA và chloroform. Chuyển phần dịch trong phía trên màng ngăn sang eppendorf 2 mL mới.

- Thêm 1 mL isopropanol và đảo đều để tủa DNA và thu được sản phẩm ở dạng cô đặc (nhằm bảo vệ DNA tránh sự phân hủy của các enzyme).

- Giữ tube ở -20ºC ít nhất 30 phút, sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.

- Rửa DNA bằng cách thêm 1 mL ethanol 70%, sau đó ly tâm 12.000 vòng trong 5 phút. Tiến hành rửa DNA 2 lần bằng ethanol.

- Hòa tan mẫu trong 30 µL nước cất 2 lần và trữ ở -20ºC để chuẩn bị thực hiện phản ứng PCR.

 Thực hiện phản ứng BOX-PCR: Sử dụng mồi BOXA1R (Koeuth et al., 2008): BOXA1R: 5’- CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC -3’

(R: mồi ngược (Reverse primer) = mồi xuôi (Forward primer))

Sản phẩm sau khi đã khuếch đại bằng phản ứng PCR được phân tích bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 1,5% có bổ sung 2‰ EtBr.

Bảng 8. Thành phần cho một phản ứng BOX-PCR 25L

Hóa chất Nồng độ Thể tích (L)

Nước cất 2 lần vô trùng 7,95

Buffer ((NH4)2SO4, - MgCl2) 10X 2,5

MgCl2 25mM 3

dNTPs 2,5mM cho mỗi loại dNTP 4

Primer BOXA1R 10pmol 2,5

BSA 100X 0,25

DMSO 100% 2,5

Taq DNA polymerase 5U.l-1 0,3

DNA ~50-100ng/l 2

Bảng 9. Các bước chu kỳ nhiệt của phản ứng BOX-PCR

Bước phản ứng Tên bước Số chu kỳ Nhiệt độ (ºC) Thời gian

1 Biến tính/tách mạch 95 2 phút 2 Biến tính Gắn mồi Kéo dài 30 92 48 65 30 giây 1 phút 2 phút

 Chuẩn bị gel agarose 1,5% trong dung dịch đệm TBE 1X:

 Hòa 0,9 g agarose trong 60 mL dung dịch đệm TBE 1X, làm tan agarose bằng lò vi sóng trong khoảng 3-4 phút. Để dung dịch gel nguội đến nhiệt độ ~50ºC, bổ sung 1,2µL EtBr, đổ dung dịch vào khuôn (đã gắn lược), để khoảng 30-45 phút cho gel đặc.

 Gỡ lược ra khỏi khuôn gel, đặt gel vào bể điện di (mức dung dịch điện di trong bể phải cao hơn mặt gel ít nhất 1 mm, dung dịch điện di sử dụng phải cùng loại với dung dịch đệm dùng chuẩn bị gel).

 Bơm mẫu vào giếng với thể tích 12 µL mẫu/giếng. Thang chuẩn sử dụng trong thí nghiệm là thang chuẩn 100bp plus (Fermentas).

 Thực hiện điện di ở điện áp 90V trong 6 giờ bằng bộ điện di một chiều. Khi quá trình điện di kết thúc, chụp hình gel bằng hệ thống Bio-RAD UV 2000 (Mỹ). So sánh phổ điện di của các dòng vi khuẩn.