- Nguyên tắc: Để khảo sát khả năng tổng hợp chitinase, các dòng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường có chitin là nguồn cacbon chính (môi trường có màu trắng đục cho thấy sự hiện diện của chitin), sau thời gian ủ, xung quanh khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn sinh chitinase sẽ xuất hiện các vòng sáng. Môi trường Chitin agar được
sử dụng trong đề tài có thành phần (tính trong 1L): 6 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 1 g NH4Cl, 0,5 g NaCl, 0,05 g yeast extract, 15 g agar, bổ sung chitin huyền phù 1% (w/v) cho đến 1 lít, pH 7.
- Phương pháp thực hiện:
Chuẩn bị bột chitin và chitin nuôi từ vỏ tôm:
Bột chitin: Vỏ tôm rửa sạch, sấy khô ở 40C. Sau đó xử lí tách protein bằng dung dịch NaOH 4% ở 70-75C trong 4 giờ, rửa sạch bằng nước cất. Tiếp tục tách khoáng bằng dung dịch HCl 8% ở nhiệt độ phòng trong 16 giờ, rửa sạch bằng nước cất. Sấy khô, xay nhuyễn thành dạng bột (Nguyễn Thị Hà et al., 2012).
Chitin nuôi: thêm từ từ 10 g bột chitin vào 200 mL HCl đậm đặc (được làm lạnh trên khay đá), khuấy đều, ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng. Thêm vào hỗn hợp 500mL ethanol 95% lạnh, khuấy nhanh, tiếp tục ủ qua đêm ở 4C. Ly tâm hỗn hợp ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong 20 phút, thu lấy kết tủa và rửa bằng nước cất cho đến khi nước rửa đạt pH7. Thêm nước cất vào tủa cho đủ 1 lít.
Các dòng vi khuẩn cần khảo sát được cấy chuyển lên môi trường đã chuẩn bị, ủ ở 30C trong 5 ngày, quan sát và ghi nhận sự xuất hiện của vòng sáng xung quanh khuẩn lạc. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần/dòng vi khuẩn. Các dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp chitinase được chọn để thực hiện thí nghiệm tiếp theo.