Phƣơng tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

Đề tài đƣợc thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển thuộc công ty Cổ phần xuất nhập khẩu y tế Domesco, từ ngày 05/08/2013 đến ngày 15/10/2013.

3.1.2 Phƣơng tiện thực hiện 3.1.2.1 Thiết bị và dụng cụ 3.1.2.1 Thiết bị và dụng cụ

- Cân phân tích Sartorius CP225D

- Bản mỏng silica gel 60 F254, Merck

- Máy quang phổ hồng ngoại FTIR-8400S, Shimadzu - Phân cực kế tự động ATAGO AP-100

- Máy sắc ký lỏng UFLC, Shimadzu

- Máy đo điểm chảy Electrothermal Model 9100

- Máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis 1700 Pharmaspec, Shimadzu - Bể siêu âm Elma S180H

- Bếp cách thủy Memmert - Tủ sấy Binder

- Buồng soi UV huỳnh quang Camag

- Máy lọc chân không (dùng để lọc pha động)

- Đầu lọc 0,45 m

- Dụng cụ thủy tinh: bình định mức, pipet, buret, bercher, đĩa petri, ống đong, cốc thủy tinh dùng để sấy mẫu (bì)…

Hình 3.1 Máy đo điểm chảy Hình 3.2 Phân cực kế tự động

Hình 3.3 Máy quang phổ hồng ngoại Hình 3.4 Máy quang phổ UV-Vis

Hình 3.5 Máy sắc ký lỏng UFLC

3.1.2.2 Hóa chất

- Nƣớc lọc RO - Acetone (Macron)

- Methylene chloride (J.T.Baker) - Ethanol 96% (Merck)

- Cồn tuyệt đối (Merck)

- Sulfuric acid đậm đặc (Merck) - Methanol (J.T.Baker)

- Potassium bromide (Merck) - Diethyl ether (Merck) - Acetonitrile (J.T.Baker) - Acetic acid băng (Merck) - 1,2-dichloroethane (Merck)

- Thuốc thử sulfuric acid 20% trong ethanol: lấy 60 mL ethanol 96% cho vào bình định mức 100 mL, cẩn thận thêm từ từ 20 mL sulfuric acid đậm đặc. Để nguội và pha loãng đến vừa đủ với ethanol 96%.

- Mometasone furoate chuẩn, hàm lƣợng 99,46% (Ấn Độ)

3.1.3 Đối tƣợng nghiên cứu

- Mometasone furoate BP/Ph.Eur (nguyên liệu): số lô MF-12025 (JM-01)- 001, sản xuất tại công ty AARTI INDUSTRIES LTD, Ấn Độ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

- Thuốc xịt mũi Nasonex 0,05% sản xuất bởi công ty Schering-Plough, USA với 2 lô: 2KTLD61001 và 1KTLDC1002.

3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Kiểm nghiệm nguyên liệu Mometasone furoate

Thực hiện theo dƣợc điển Anh 2012 (BP 2012) và tiêu chuẩn nhà sản xuất cung cấp.

3.2.1.1 Cảm quan

Lấy khoảng 5,000 g mẫu thử (nguyên liệu Mometasone furoate) trải mỏng trên một đĩa petri thủy tinh, quan sát bằng mắt thƣờng.

3.2.1.2 Tính tan

Lấy 4 ống nghiệm sạch khô, đánh dấu thứ tự, lần lƣợt thêm mẫu thử và dung môi hòa tan thích hợp theo Bảng 3.1.

Bảng 3.1: Chuẩn bị mẫu khảo sát tính tan của Mometasone furoate

Ống nghiệm 1 2 3 4

Khối lƣợng mẫu thử (g) 0,010 1,000 1,000 0,100

Dung môi hòa tan Nƣớc

(100 mL) Acetone (30 mL) Methylene chloride (30 mL) Ethanol 96% (100 mL) Lắc mỗi ống nghiệm trong vài phút. Để yên. Ghi nhận tính tan.

3.2.1.3 Định tính

 Phổ hồng ngoại (IR)

- Mẫu chuẩn: nghiền nhỏ khoảng 0,002-0,003 g Mometasone furoate chuẩn với khoảng 0,300-0,400 g potassium bromide khan. Cẩn thận nghiền mịn hỗn hợp, trải đều và dập thành viên. Tiến hành đo và ghi nhận phổ đồ.

- Mẫu thử: nghiền nhỏ khoảng 0,002-0,003 g mẫu thử với khoảng 0,300- 0,400 g potassium bromide khan. Cẩn thận nghiền mịn hỗn hợp, trải đều và dập thành viên. Tiến hành đo và ghi nhận phổ đồ.

 Sắc ký lớp mỏng

- Dung môi khai triển: H2O:CH3OH:(C2H5)2O:CH2Cl2 = 1,2:8:15:77

- Dung dịch chuẩn và dung dịch thử: pha dung dịch chuẩn và thử ở nồng độ 1 mg/mL trong methylene chloride.

- Tiến hành:

+ Chấm riêng biệt trên bản mỏng 10 L mỗi dung dịch chuẩn và dung

dịch thử. Khai triển bản mỏng trong dung môi khai triển đến khi dung môi đi đƣợc một đoạn khoảng 10 cm. Lấy bản mỏng ra và làm khô trong không khí.

+ Phát hiện A: quan sát dƣới ánh sáng UV 254 nm.

+ Phát hiện B: phun thuốc thử sulfuric acid 20% trong ethanol, nung nóng ở 120ºC trong vòng 10 phút hoặc cho đến khi các vết xuất hiện. Để nguội, quan sát dƣới ánh sáng ban ngày và UV 366 nm.

3.2.1.4 Điểm chảy

Nghiền mẫu thử thành bột mịn (nếu mẫu thử ở dạng tinh thể). Sau đó cho bột vào một ống mao quản, lèn bột bằng cách gõ nhẹ ống mao quản xuống mặt phẳng cứng để có một lớp bột cao 4-6 mm.

Cài đặt nhiệt độ cho máy: nhiệt độ nền: 220ºC, tốc độ gia nhiệt: 1ºC/phút. Khi máy đạt nhiệt độ nền, đặt ống mao quản chứa mẫu thử vào máy. Quan sát và ghi nhận nhiệt độ điểm chảy. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

3.2.1.5 Góc quay cực riêng

Cân chính xác 0,250 g mẫu thử cho vào bình định mức 50 mL, hòa tan và pha loãng vừa đủ với cồn tuyệt đối. Lắc đều.

Tiến hành hiệu chỉnh (auto zero) với mẫu trắng là cồn tuyệt đối rồi xác định góc quay cực riêng của mẫu thử.

3.2.1.6 Mất khối lƣợng do làm khô

Sấy khô bì trong tủ sấy ở nhiệt độ 1052ºC trong vòng 30 phút. Lấy ra và để

nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm chứa silica gel. Cân để xác định khối lƣợng bì.

dày không quá 10 mm. Đặt bì chứa mẫu vào tủ sấy ở 1052ºC và sấy cho đến khi

khối lƣợng không đổi.

Cân lại để xác định khối lƣợng mẫu bị mất do làm khô. Khối lƣợng mẫu bị mất do làm khô đƣợc tính theo công thức:

 (%) = (khối lƣợng bì + khối lƣợng mẫu) – (khối lƣợng bì + mẫu)

khối lƣợng mẫu × 100

3.2.1.7 Định lƣợng

- Mẫu chuẩn: cân chính xác 12,5 mg Mometasone furoate chuẩn cho vào bình định mức 25 mL. Hòa tan và pha loãng vừa đủ với ethanol 96%. Lắc đều. Hút chính xác 2 mL dung dịch này cho vào bình định mức 100 mL và pha loãng vừa đủ với ethanol 96%. Lắc đều.

- Mẫu thử: cân chính xác 50 mg mẫu thử cho vào bình định mức 100 mL. Hòa tan và pha loãng vừa đủ với ethanol 96%. Lắc đều. Hút chính xác 2 mL dung dịch này cho vào bình định mức 100 mL và pha loãng vừa đủ với ethanol 96%. Lắc đều.

- Tiến hành đo độ hấp thụ của mẫu chuẩn và mẫu thử ở bƣớc sóng 249 nm. Thực hiện trong cùng điều kiện với mẫu trắng là ethanol 96%.

Hàm lƣợng Mometasone furoate trong mẫu thử đƣợc tính theo công thức:

% Mometasone furoate = AT × mC (tinh khiết) × 100 × 100

AC × mT × 25

Trong đó: AT là độ hấp thụ của mẫu thử tại bƣớc sóng 249 nm

AC là độ hấp thụ của mẫu chuẩn tại bƣớc sóng 249 nm

mT là khối lƣợng của mẫu thử (mg)

mC (tinh khiết) là khối lƣợng của chuẩn tinh khiết (mg)

3.2.1.8 Tạp chất liên quan Điều kiện sắc ký: - Cột C18 (25 cm  4,6 mm, 5 m) - Detector: UV - Bƣớc sóng: 254 nm - Nhiệt độ cột: 30ºC - Thể tích tiêm: 20,0 L

- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút

- Pha động: acetonitrile:nƣớc = 50:50

Tiến hành:

- Dung môi pha loãng: hỗn hợp gồm 50 mL acetonitrile và 50 mL nƣớc, thêm 0,1 mL acetic acid băng.

- Dung dịch thử: cân chính xác khoảng 20,0 mg mẫu thử cho vào bình định mức 20 mL. Hòa tan trong 4 mL acetonitrile, pha loãng đến vừa đủ với dung môi pha loãng. Lắc đều. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

- Dung dịch đối chiếu: pha loãng 1,0 mL dung dịch thử thành 20,0 mL với dung môi pha loãng. Lắc đều. Hút chính xác 1 mL dung dịch này cho vào bình định mức 10 mL, pha loãng vừa đủ với dung môi pha loãng. Lắc đều.

- Lọc mẫu trắng, dung dịch đối chiếu và dung dịch thử qua giấy lọc 0,45

m.

- Tiêm mẫu trắng, dung dịch đối chiếu và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký. Ghi nhận sắc ký đồ. Tính toán phần trăm mỗi tạp riêng lẻ trong dung dịch thử rồi so sánh với các mức chất lƣợng sau:

+ Tạp riêng lẻ bất kỳ: không quá 0,6 lần diện tích peak chính của dung dịch đối chiếu (0,3%).

+ Tổng tạp: không quá 1,2 lần diện tích peak chính của dung dịch đối chiếu (0,6%).

+ Giới hạn bỏ qua: 0,1 lần diện tích peak chính của dung dịch đối chiếu (0,05%).

Phần trăm mỗi tạp riêng lẻ trong dung dịch thử đƣợc tính theo công thức:

% tạp riêng lẻ = STạp

SĐC ×0,5

Trong đó: STạp là diện tích peak trung bình của mỗi tạp riêng lẻ trong

dung dịch thử

SĐC là diện tích peak trung bình của Mometasone furoate

3.2.2 Kiểm nghiệm thành phẩm Nasonex

Dựa trên kết quả tham khảo từ BP 2012, đề tài đề xuất xây dựng phƣơng pháp định lƣợng Mometasone furoate trong thành phẩm bằng phƣơng pháp HPLC, có sự biến đổi so với BP 2012 cho phù hợp với dạng bào chế và điều kiện thực tiễn tại phòng kiểm nghiệm của công ty Domesco.

Nguyên liệu Mometasone furoate sau khi kiểm nghiệm nếu đạt các chỉ tiêu chất lƣợng so với BP 2012 và tiêu chuẩn của nhà sản xuất sẽ đƣợc dùng làm chuẩn đối chiếu để kiểm nghiệm thành phẩm Nasonex.

3.2.2.1 Cảm quan

Lấy khoảng 5,000 g dịch chất (thành phẩm Nasonex) cho vào một đĩa petri thủy tinh, quan sát bằng mắt thƣờng.

3.2.2.2 Định tính

 Sắc ký lớp mỏng

- Dung môi khai triển: CH3OH:1,2-dichloroethane = 3:97

- Dung dịch chuẩn: pha dung dịch chuẩn Mometasone furoate ở nồng độ 1 mg/mL trong acetone.

- Dung dịch thử: lấy chính xác một lƣợng dịch chất (sau khi lắc đều) tƣơng ứng khoảng 1 mg Mometasone furoate cho vào bercher 100 mL, thêm vào khoảng 10 mL methylene chloride. Khuấy đều. Cách thủy ở 40-50ºC trong khoảng 5 phút. Để nguội. Gạn lấy lớp dung dịch không màu. Lặp lại thêm 2 lần, mỗi lần với 10 mL methylene chloride. Thu gom lớp dung dịch không màu, làm bay hơi dung môi đến cô cạn và hòa tan trở lại với 1 mL acetone.

- Tiến hành:

+ Chấm riêng biệt trên bản mỏng 20 L mỗi dung dịch chuẩn và dung

dịch thử. Khai triển bản mỏng trong dung môi khai triển đến khi dung môi đi đƣợc một đoạn khoảng 10 cm. Lấy bản mỏng ra và làm khô trong không khí.

+ Phát hiện: quan sát dƣới ánh sáng UV 254 nm hoặc phun thuốc thử sulfuric acid 20% trong ethanol, nung nóng ở 120ºC trong vòng 10 phút hoặc cho đến khi các vết xuất hiện, để nguội, quan sát dƣới ánh sáng ban ngày.

 Sắc ký lỏng (HPLC) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

So sánh sắc ký đồ của dung dịch chuẩn và dung dịch thử thu đƣợc từ kết quả định lƣợng. 3.2.2.3 Định lƣợng Điều kiện sắc ký: - Cột C18 (10 cm  3 mm, 3 m) - Detector: UV - Bƣớc sóng: 238 nm - Nhiệt độ cột: 60ºC - Thể tích tiêm: 5,0 L - Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút

- Pha động: H2O:CH3OH = 30:70, điều chỉnh tỉ lệ nếu cần

Tiến hành

- Dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 20 mg Mometasone furoate chuẩn cho vào bình định mức 100 mL. Thêm methanol đến vừa đủ. Lắc đều. Hút chính xác 5 mL dung dịch này cho vào bình định mức 50 mL, pha loãng vừa đủ với methanol. Lắc đều.

- Dung dịch thử: lấy chính xác một lƣợng dịch chất (sau khi lắc đều) tƣơng ứng khoảng 1 mg Mometasone furoate cho vào bình định mức 50 mL, thêm khoảng 30-40 mL methanol. Siêu âm khoảng 15 phút. Cách thủy ở 60-70ºC trong vòng 10 phút. Để nguội, thêm tiếp methanol đến vừa đủ. Lắc đều.

- Lọc dung dịch thử và dung dịch chuẩn qua giấy lọc 0,45 m.

- Tiêm dung dịch chuẩn và thử vào hệ thống sắc ký. Ghi lại sắc ký đồ.

Hàm lƣợng Mometasone furoate theo lƣợng Mometasone furoate ghi trên nhãn đƣợc xác định bằng công thức:

% Mometasone furoate = ST

SC ×

mC (tinh khiết)

mT × 0,05 × 5 × 100

Trong đó: ST là diện tích peak trung bình của Mometasone furoate

trong dung dịch thử

SC là diện tích peak trung bình của Mometasone furoate

mT là khối lƣợng của mẫu thử (mg)

mC (tinh khiết) là khối lƣợng của chuẩn tinh khiết (mg)

3.2.3 Thẩm định quy trình phân tích thành phẩm Nasonex bằng HPLC

Các số liệu thu đƣợc trong quá trình thẩm định đƣợc tiến hành thống kê và xử lý bằng Excel.

3.2.3.1 Khảo sát tính đặc hiệu của Mometasone furoate

Mục đích: Xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích (Mometasone

furoate), không bị ảnh hƣởng bởi sự có mặt của các chất khác có trong mẫu thử.

Tiến hành:

- Mẫu trắng: dung môi methanol.

- Lọc mẫu trắng, dung dịch chuẩn và dung dịch thử qua giấy lọc 0,45 m.

- Tiêm lần lƣợt mẫu trắng, dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký. Ghi lại sắc ký đồ.

3.2.3.2 Khảo sát tính tuyến tính theo nồng độ Mometasone furoate (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Mục đích: Khảo sát tính tuyến tính của dãy chuẩn: 20%, 80%, 100%, 120%,

180% so với nồng độ chuẩn định lƣợng.

- Xác định phƣơng trình hồi quy y = ax + b và hệ số tƣơng quan tuyến tính (r) giữa nồng độ và diện tích peak Mometasone furoate.

Tiến hành:

- Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác 20 mg Mometasone furoate chuẩn cho vào bình định mức 100 mL. Thêm methanol vừa đủ. Lắc đều.

- Dùng buret 25 mL lấy chính xác từng thể tích xác định của dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 50 mL và thêm methanol vừa đủ để đƣợc các dung dịch chuẩn theo Bảng 3.2.

Bảng 3.2: Chuẩn bị mẫu khảo tính tuyến tính theo nồng độ Mometasone furoate STT Nồng độ Mometasone furoate (%) Nồng độ Mometasone furoate (g/mL) Dung dịch chuẩn gốc (mL) Thể tích vừa đủ (mL) 1 20 4,0 1,0 50 2 80 16,0 4,0 3 100 20,0 5,0 4 120 24,0 6,0 5 180 36,0 9,0

- Lọc các dung dịch chuẩn qua giấy lọc 0,45 m.

- Tiêm lần lƣợt các dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký. Ghi lại sắc ký đồ.

3.2.3.3 Khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp

Mục đích: Xác định giá trị độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) của phƣơng pháp

định lƣợng. RSD càng nhỏ phƣơng pháp có độ chính xác càng cao (RSD ≤ 2%).

Tiến hành:

- Dung dịch thử (cân 6 bình thử trên cùng một chế phẩm): lấy chính xác một lƣợng dịch chất (sau khi lắc đều) tƣơng ứng khoảng 1 mg Mometasone furoate cho vào bình định mức 50 mL, thêm khoảng 30-40 mL methanol. Siêu âm khoảng 15 phút. Cách thủy ở 60-70ºC trong vòng 10 phút. Thêm tiếp methanol đến vừa đủ. Lắc đều.

- Lọc dung dịch chuẩn và dung dịch thử qua giấy lọc 0,45 m.

- Tiêm lần lƣợt dung dịch chuẩn và các dung dịch thử vào hệ thống sắc ký. Ghi lại sắc ký đồ.

X (%) = ST

SC × mC (tinh khiết)

mT ×5

Trong đó: ST là diện tích peak trung bình của Mometasone furoate trong

dung dịch thử

SC là diện tích peak trung bình của Mometasone furoate

trong dung dịch chuẩn

mT là khối lƣợng cân mẫu thử (mg)

mC (tinh khiết) là khối lƣợng của chuẩn tinh khiết (mg)

3.2.3.4Khảo sát độ đúng của phƣơng pháp

Mục đích: Xác định tỉ lệ phục hồi (%) của chuẩn Mometasone furoate khi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

cho vào mẫu thử (chế phẩm) ở các mức: 10%, 15%, 20% so với nồng độ thử định lƣợng.

Tiến hành:

- Dung dịch thử: lấy chính xác một lƣợng dịch chất (sau khi lắc đều) tƣơng ứng khoảng 0,9 mg Mometasone furoate cho vào bình định mức 50 mL. Thêm khoảng 20 mL methanol vào. Siêu âm khoảng 15 phút. Cách thủy ở 60-70ºC

Mục lục