Thẩm định quy trình phân tích thành phẩm Nasonex b- 123docz.net

Các số liệu thu đƣợc trong quá trình thẩm định đƣợc tiến hành thống kê và xử lý bằng Excel.

3.2.3.1 Khảo sát tính đặc hiệu của Mometasone furoate

Mục đích: Xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích (Mometasone

furoate), không bị ảnh hƣởng bởi sự có mặt của các chất khác có trong mẫu thử.

Tiến hành:

- Dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 20 mg Mometasone furoate chuẩn cho vào bình định mức 100 mL. Thêm methanol đến vừa đủ. Lắc đều. Hút chính xác 5 mL dung dịch này cho vào bình định mức 50 mL, pha loãng vừa đủ với methanol. Lắc đều.

- Dung dịch thử: lấy chính xác một lƣợng dịch chất (sau khi lắc đều) tƣơng ứng khoảng 1 mg Mometasone furoate cho vào bình định mức 50 mL, thêm khoảng 30-40 mL methanol. Siêu âm khoảng 15 phút. Cách thủy ở 60-70ºC trong vòng 10 phút. Để nguội, thêm tiếp methanol đến vừa đủ. Lắc đều.

- Mẫu trắng: dung môi methanol.

- Lọc mẫu trắng, dung dịch chuẩn và dung dịch thử qua giấy lọc 0,45 m.

- Tiêm lần lƣợt mẫu trắng, dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký. Ghi lại sắc ký đồ.

3.2.3.2 Khảo sát tính tuyến tính theo nồng độ Mometasone furoate

Mục đích: Khảo sát tính tuyến tính của dãy chuẩn: 20%, 80%, 100%, 120%,

180% so với nồng độ chuẩn định lƣợng.

- Xác định phƣơng trình hồi quy y = ax + b và hệ số tƣơng quan tuyến tính (r) giữa nồng độ và diện tích peak Mometasone furoate.

Tiến hành:

- Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác 20 mg Mometasone furoate chuẩn cho vào bình định mức 100 mL. Thêm methanol vừa đủ. Lắc đều.

- Dùng buret 25 mL lấy chính xác từng thể tích xác định của dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 50 mL và thêm methanol vừa đủ để đƣợc các dung dịch chuẩn theo Bảng 3.2.

Bảng 3.2: Chuẩn bị mẫu khảo tính tuyến tính theo nồng độ Mometasone furoate STT Nồng độ Mometasone furoate (%) Nồng độ Mometasone furoate (g/mL) Dung dịch chuẩn gốc (mL) Thể tích vừa đủ (mL) 1 20 4,0 1,0 50 2 80 16,0 4,0 3 100 20,0 5,0 4 120 24,0 6,0 5 180 36,0 9,0

- Lọc các dung dịch chuẩn qua giấy lọc 0,45 m.

- Tiêm lần lƣợt các dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký. Ghi lại sắc ký đồ.

3.2.3.3 Khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp

Mục đích: Xác định giá trị độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) của phƣơng pháp

định lƣợng. RSD càng nhỏ phƣơng pháp có độ chính xác càng cao (RSD ≤ 2%).

Tiến hành:

- Dung dịch thử (cân 6 bình thử trên cùng một chế phẩm): lấy chính xác một lƣợng dịch chất (sau khi lắc đều) tƣơng ứng khoảng 1 mg Mometasone furoate cho vào bình định mức 50 mL, thêm khoảng 30-40 mL methanol. Siêu âm khoảng 15 phút. Cách thủy ở 60-70ºC trong vòng 10 phút. Thêm tiếp methanol đến vừa đủ. Lắc đều.

- Lọc dung dịch chuẩn và dung dịch thử qua giấy lọc 0,45 m.

- Tiêm lần lƣợt dung dịch chuẩn và các dung dịch thử vào hệ thống sắc ký. Ghi lại sắc ký đồ.

X (%) = ST

SC × mC (tinh khiết)

mT ×5

Trong đó: ST là diện tích peak trung bình của Mometasone furoate trong

dung dịch thử

SC là diện tích peak trung bình của Mometasone furoate

trong dung dịch chuẩn

mT là khối lƣợng cân mẫu thử (mg)

mC (tinh khiết) là khối lƣợng của chuẩn tinh khiết (mg)

3.2.3.4Khảo sát độ đúng của phƣơng pháp

Mục đích: Xác định tỉ lệ phục hồi (%) của chuẩn Mometasone furoate khi

cho vào mẫu thử (chế phẩm) ở các mức: 10%, 15%, 20% so với nồng độ thử định lƣợng.

Tiến hành:

- Dung dịch thử: lấy chính xác một lƣợng dịch chất (sau khi lắc đều) tƣơng ứng khoảng 0,9 mg Mometasone furoate cho vào bình định mức 50 mL. Thêm khoảng 20 mL methanol vào. Siêu âm khoảng 15 phút. Cách thủy ở 60-70ºC trong vòng 10 phút. Để nguội. Dùng buret 25 mL thêm chính xác từng thể tích xác định của dung dịch chuẩn vào rồi thêm methanol vừa đủ để đƣợc các dung dịch thử theo Bảng 3.3.

Bảng 3.3: Chuẩn bị mẫu khảo sát độ đúng của phƣơng pháp

Các mức độ đúng 10% 15% 20%

Lƣợng dịch chất (g) 1,8 1,8 1,8

Lƣợng chuẩn thêm vào (mL) 5,0 7,5 10,0

Thể tích vừa đủ (mL) 50

- Lọc dung dịch chuẩn và dung dịch thử qua giấy lọc 0,45 m.

- Tiêm lần lƣợt dung dịch chuẩn và các dung dịch thử vào hệ thống sắc ký. Ghi lại sắc ký đồ.

Tổng lƣợng Mometasone furoate tìm thấy đƣợc tính theo công thức:

mMF (mg) = ST

SC ×

mC (tinh khiết)

100 ×5

Trong đó: ST là diện tích peak trung bình của Mometasone furoate trong

dung dịch thử

SC là diện tích peak trung bình của Mometasone furoate

trong dung dịch chuẩn

mC (tinh khiết) là khối lƣợng của chuẩn tinh khiết (mg)

3.2.3.5 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) của Mometasone furoate

Mục đích: Xác định nồng độ thấp nhất của Mometasone furoate trong mẫu

thử mà phƣơng pháp có thể phát hiện đƣợc.

Tiến hành: Từ phƣơng trình hồi quy tuyến tính y = ax + b tính đƣợc giới hạn

phát hiện của phƣơng pháp.

3.2.3.6Xác định giới hạn định lƣợng (LOQ) của Mometasone furoate

Mục đích: Xác định nồng độ thấp nhất của Mometasone furoate trong mẫu

thử còn có thể định lƣợng đƣợc với độ đúng và độ chính xác thích hợp.

Tiến hành: Từ phƣơng trình hồi quy tuyến tính y = ax + b tính đƣợc giới hạn

CHƢƠNG 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 KIỂM NGHIỆM NGUYÊN LIỆU MOMETASONE FUROATE 4.1.1 Cảm quan 4.1.1 Cảm quan

Quan sát mẫu thử trải trên đĩa petri thấy mẫu có dạng bột mịn, màu trắng.

Nhận xét: Kết quả quan sát cảm quan cho thấy nguyên liệu Mometasone furoate đạt yêu cầu chất lƣợng so với BP 2012 và tiêu chuẩn của nhà sản xuất (bột màu trắng hoặc gần nhƣ trắng).

4.1.2 Tính tan

Lần lƣợt cho mẫu thử và dung môi hòa tan thích hợp vào các ống nghiệm đã đƣợc đánh số. Tính tan của Mometasone furoate đƣợc ghi nhận ở Bảng 4.1.

Bảng 4.1: Tính tan của nguyên liệu Mometasone furoate

Ống nghiệm 1 2 3 4

Dung môi hòa tan Nƣớc Acetone Methylene chloride Ethanol 96%

Hiện tƣợng Không tan Tan Tan Tan

Nhận xét: Nguyên liệu Mometasone furoate không tan trong nƣớc, tan trong acetone và methylene chloride, ít tan trong ethanol 96%. Nhƣ vậy tính tan của nguyên liệu Mometasone furoate đạt yêu cầu chất lƣợng so với BP 2012 và tiêu chuẩn của nhà sản xuất.

4.1.3 Định tính

 Phổ hồng ngoại (IR)

Hình 4.2 Phổ hồng ngoại (IR) của nguyên liệu Mometasone furoate

Nhận xét: Phổ IR của nguyên liệu Mometasone furoate phù hợp với phổ IR của Mometasone furoate chuẩn, cho thấy có sự hiện diện của Mometasone furoate trong nguyên liệu, đạt yêu cầu chất lƣợng so với BP 2012 và tiêu chuẩn của nhà sản xuất. Đồng thời, kết quả phổ IR còn cho thấy một số nhóm chức đặc trƣng

của Mometasone furoate: C=C (khoảng 1700-1650 cm-1

), C=O (khoảng 1750-

1700 cm-1), -OH (khoảng 3200-3600 cm-1).

 Sắc ký lớp mỏng

Khai triển bản mỏng chứa dung dịch thử và dung dịch chuẩn trong hệ dung môi khai triển đã nêu. Sau khi kết thúc, lấy bản mỏng ra và làm khô trong không khí.

- Phát hiện A: quan sát dƣới ánh sáng UV 254 nm.

Hình 4.3 Sắc ký đồ của Mometasone furoate quan sát dƣới UV 254 nm Sắc ký đồ thu đƣợc gồm 2 vết chính màu sẫm tối trên nền bản màu xanh lục:

Rf (C) = 0,68 Rf (T) = 0,68

Trong đó: C là vết của dung dịch chuẩn T là vết của dung dịch thử

- Phát hiện B: phun thuốc thử sulfuric acid 20% trong ethanol. + Quan sát dƣới ánh sáng ban ngày

Hình 4.4 Sắc ký đồ của Mometasone furoate sau khi phun thuốc thử sulfuric acid 20% trong ethanol, quan sát dƣới ánh sáng ban ngày

+ Quan sát dƣới ánh sáng UV 366 nm

Hình 4.5 Sắc ký đồ của Mometasone furoate sau khi phun thuốc thử sulfuric acid 20% trong ethanol, quan sát dƣới UV 366 nm

Nhận xét: Quan sát dƣới ánh sáng UV 254 nm và ánh sáng ban ngày (sau khi phun thuốc thử sulfuric acid 20% trong ethanol), vết chính thu đƣợc trên sắc Sắc ký đồ thu đƣợc gồm 2 vết chính màu nâu đen trên nền bản màu trắng:

Rf (C) = 0,68 Rf (T) = 0,68

Trong đó: C là vết của dung dịch chuẩn T là vết của dung dịch thử

Sắc ký đồ thu đƣợc gồm 2 vết chính màu sáng đen trên nền bản màu xanh tím:

Rf (C) = 0,68 Rf (T) = 0,68

Trong đó: C là vết của dung dịch chuẩn T là vết của dung dịch thử

ký đồ của dung dịch thử tƣơng ứng về vị trí, kích thƣớc và màu sắc với vết chính thu đƣợc trên sắc ký đồ của Mometasone furoate chuẩn.

Quan sát dƣới ánh sáng UV 366 nm, vết chính thu đƣợc trên sắc ký đồ của dung dịch thử tƣơng ứng về vị trí, kích thƣớc và màu sắc với vết chính thu đƣợc trên sắc ký đồ của Mometasone furoate chuẩn, đồng thời có sự phát quang.

Từ kết quả quan sát trên cho thấy có sự hiện diện Mometasone furoate trong nguyên liệu. Bên cạnh đó cũng cho thấy tính chất phát quang dƣới ánh sáng UV 366 nm sau khi đƣợc phun với sulfuric acid 20% trong ethanol của Mometasone furoate, đạt yêu cầu chất lƣợng so với BP 2012 và tiêu chuẩn của nhà sản xuất.

4.1.4 Điểm chảy

Đo điểm chảy của mẫu thử với nhiệt độ nền 220ºC, tốc độ gia nhiệt 1ºC/phút. Kết quả đo đƣợc trình bày ở Bảng 4.2.

Bảng 4.2: Kết quả đo điểm chảy của nguyên liệu Mometasone furoate

Điểm chảy (ºC) Hiện tƣợng

Mẫu thử 1 216,8

Mẫu thử chuyển hoàn toàn từ trạng thái rắn sang trạng thái

lỏng, đồng thời có màu đen

Mẫu thử 2 217,9

Trung bình 217,4

Nhận xét: Điểm chảy trung bình của nguyên liệu Mometasone furoate là 217,4ºC kèm theo sự phân hủy, đạt yêu cầu chất lƣợng so với BP 2012 và tiêu chuẩn của nhà sản xuất.

4.1.5 Góc quay cực riêng

Sau khi auto zero với mẫu trắng là cồn tuyệt đối, đo góc quay cực riêng của mẫu thử. Kết quả đo đƣợc trình bày ở Bảng 4.3.

Bảng 4.3: Kết quả đo góc quay cực riêng của nguyên liệu Mometasone furoate

Lần đo 1 2 3 4 5 Trung bình

Mẫu thử 1 +53,24º +52,24º +54,25º +53,96º +51,96º

+52,95º

Mẫu thử 2 +51,96º +53,96º +51,96º +51,96º +53,96º

Nhận xét: Góc quay cực riêng của nguyên liệu Mometasone furoate là +52,95º, đạt yêu cầu chất lƣợng so với BP 2012 và tiêu chuẩn của nhà sản xuất (từ +50º đến +55º).

4.1.6 Mất khối lƣợng do làm khô

Mẫu thử đƣợc sấy đến khối lƣợng không đổi ở 1052ºC. Khối lƣợng mẫu bị

mất do làm khô đƣợc trình bày ở Bảng 4.4.

Bảng 4.4: Khối lƣợng bị mất do làm khô của nguyên liệu Mometasone furoate Khối lƣợng bì (g) Khối lƣợng mẫu (g) Khối lƣợng bì + mẫu (g)  (%) Trung bình (%) Mẫu thử 1 17,7523 1,0028 18,7532 0,19 0,19 Mẫu thử 2 19,1653 1,0002 20,1636 0,19

Nhận xét: Khối lƣợng bị mất do làm khô của nguyên liệu Mometasone furoate trung bình là 0,19%, đạt yêu cầu chất lƣợng so với BP 2012 và tiêu chuẩn của nhà sản xuất (< 0,5%).

4.1.7 Định lƣợng

Tiến hành đo độ hấp thụ của mẫu chuẩn và mẫu thử ở bƣớc sóng 249 nm. Kết quả đo đƣợc trình bày ở Bảng 4.5.

Bảng 4.5: Kết quả định lƣợng nguyên liệu Mometasone furoate

Chuẩn

- Khối lƣợng cân chuẩn: mC = 12,92 mg

(hàm lƣợng = 99,46%, nguyên trạng)  mC (tinh khiết) = 12,85 mg

- Độ hấp thụ: AC = 0,493 Khối lƣợng cân (mg) Độ ẩm  (%) Khối lƣợng mẫu (mg) Độ hấp thụ Hàm lƣợng (%) Trung bình (%) Thử 1 50,80 0,19 50,70 0,487 100,15 100,12 Thử 2 50,21 50,11 0,481 100,07

Nhận xét: Hàm lƣợng trung bình của Mometasone furoate có trong nguyên liệu là 100,12%, đạt yêu cầu chất lƣợng so với BP 2012 và tiêu chuẩn của nhà sản xuất (từ 97,0% đến 103,0%).

Tiêm mẫu trắng, dung dịch đối chiếu và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký với điều kiện sắc ký đã nêu và ghi nhận sắc ký đồ.

Hình 4.6 Sắc ký đồ mẫu trắng xác định tạp chất liên quan của nguyên liệu Mometasone furoate (HPLC)

Hình 4.7 Sắc ký đồ dung dịch đối chiếu xác định tạp chất liên quan của nguyên liệu Mometasone furoate (HPLC)

Hình 4.8 Sắc ký đồ dung dịch thử xác định tạp chất liên quan của nguyên liệu Mometasone furoate (HPLC)

Bảng 4.6: Tạp chất liên quan của nguyên liệu Mometasone furoate

Dung dịch đối chiếu

SĐC = 282.358

0,6  SĐC = 169.414,8

1,2  SĐC = 338.829,6

0,1  SĐC = 28.235,8

Dung dịch thử Khối lƣợng cân: m= 20,17 mg

STạp = 0

Kết quả Không phát hiện

Nhận xét: Các tạp liên quan trong nguyên liệu Mometasone furoate đều có hàm lƣợng < 0,05% (giới hạn bỏ qua), đạt yêu cầu chất lƣợng so với BP 2012 và tiêu chuẩn của nhà sản xuất.

 Kết quả kiểm nghiệm các chỉ tiêu của nguyên liệu Mometasone furoate

đƣợc trình bày tóm tắt ở Bảng 4.7.

Bảng 4.7: Tóm tắt kết quả kiểm nghiệm nguyên liệu Mometasone furoate

Chỉ tiêu Mức chất lƣợng (BP 2012) Kết quả

Mô tả + Cảm quan + Tính tan

Bột trắng hoặc gần nhƣ trắng. Hầu nhƣ không tan trong nƣớc, tan trong acetone và methylene chloride, ít tan trong ethanol 96%.

Đạt Đạt

Định tính Phải có phép thử đặc trƣng của

Mometasone furoate.

Đúng

Góc quay cực riêng Từ +50º đến +55º, tính theo chế

phẩm khan.

Đạt (+52,95º)

Điểm chảy Khoảng 220ºC, kèm phân hủy. Đạt (217,4ºC)

Mất khối lƣợng do

làm khô Không quá 0,5%, tại 105ºC. Đạt (0,19%)

Định lƣợng Từ 97,0% đến 103,0%, tính theo

chế phẩm khan.

Đạt (100,12%)

Tạp chất liên quan Tạp riêng lẻ: không quá 0,3%.

Tổng tạp: không quá 0,6%.

Đạt (không phát hiện) Đạt (không phát hiện)

Nhận xét: Tất cả các chỉ tiêu kiểm nghiệm của nguyên liệu Mometasone furoate đều đạt yêu cầu chất lƣợng so với BP 2012 và tiêu chuẩn của nhà sản xuất.

Nguyên liệu Mometasone furoate đã đạt yêu cầu chất lƣợng có thể sử dụng làm chuẩn đối chiếu để kiểm nghiệm thành phẩm Nasonex.

4.2 KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẨM NASONEX 4.2.1 Cảm quan 4.2.1 Cảm quan

Quan sát mẫu thử trên đĩa petri thấy mẫu là hỗn dịch dạng lỏng, màu trắng đục.

Nhận xét: Kết quả quan sát cảm quan cho thấy thành phẩm Nasonex đạt yêu cầu chất lƣợng so với BP 2012.

4.2.2 Định tính

 Sắc ký lớp mỏng

Khai triển bản mỏng chứa dung dịch thử và dung dịch chuẩn trong hệ dung môi khai triển đã nêu. Sau khi kết thúc, lấy bản mỏng ra và làm khô trong không khí. Quan sát dƣới ánh sáng UV 254 nm.

Hình 4.9 Sắc ký đồ định tính thành phẩm Nasonex, quan sát dƣới UV 254 nm

Nhận xét: Vết chính thu đƣợc trên sắc ký đồ của dung dịch thử tƣơng ứng về vị trí, kích thƣớc và màu sắc với vết chính thu đƣợc trên sắc ký đồ của Mometasone furoate chuẩn cho thấy có sự hiện diện của Mometasone furoate trong thành phẩm Nasonex, đạt yêu cầu chất lƣợng so với BP 2012.

 Sắc ký lỏng (HPLC)

Ghi nhận sắc ký đồ của dung dịch chuẩn và dung dịch thử thu đƣợc từ phép thử định lƣợng thành phẩm Nasonex.

Hình 4.10 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn định tính thành phẩm Nasonex (HPLC) Trên sắc ký đồ thu đƣợc 2 vết chính màu sẫm tối trên nền bản màu xanh lục:

Rf (C) = 0,26 Rf (T) = 0,26

Trong đó: C là vết của dung dịch chuẩn T là vết của dung dịch thử

Hình 4.11 Sắc ký đồ dung dịch thử định tính thành phẩm Nasonex (HPLC)

Nhận xét: Peak chính thu đƣợc trên sắc ký đồ của dung dịch thử có thời

gian lƣu (tR (T) = 4,60 phút) tƣơng ứng với thời gian lƣu của peak chính thu đƣợc

trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (tR (C) = 4,60 phút), cho thấy có sự hiện diện

của Mometasone furoate trong thành phẩm Nasonex, đạt yêu cầu chất lƣợng so với BP 2012.

4.2.3 Định lƣợng

Tiêm dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký với điều kiện sắc ký đã nêu và ghi nhận sắc ký đồ. Kết quả xác định hàm lƣợng Mometasone

Thẩm định quy trình phân tích thành phẩm Nasonex bằng HPLC

Nguyên tắc, cấu tạo hệ thống máy HPLC

Thẩm định quy trình phân tích