Để thẩm định một quy trình phân tích dựa vào các chỉ tiêu sau: tính đặc hiệu (specificity), độ chính xác (precision), độ lặp lại (repeatability), độ chính xác trung gian (intermediate precision), độ tái lặp (reproducibility), độ đúng (accuracy), giới hạn phát hiện (limit of detection), giới hạn định lƣợng (limit of quantitation), tính tuyến tính (linearity), khoảng xác định (range) [14-17].
Mục đích của quy trình phân tích phải đƣợc hiểu rõ ràng để quyết định các chỉ tiêu cần đƣợc đánh giá. Thông thƣờng, thẩm định quy trình định lƣợng cần xem xét đánh giá một số chỉ tiêu [18]:
2.4.2.1 Tính đặc hiệu (Specificity)
Tính đặc hiệu hay còn gọi là tính chọn lọc (selectivity) của một quy trình phân tích là khả năng của quy trình cho phép xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích và không bị ảnh hƣởng bởi sự có mặt của các thành phần khác có trong mẫu thử. Thông thƣờng các thành phần này gồm tạp chất, sản phẩm phân hủy, chất nền,…[15-18]
Quy trình dùng để xác định tính đặc hiệu phụ thuộc vào mục tiêu đã định của quy trình phân tích. Không phải lúc nào cũng xác định đƣợc một quy trình phân tích đặc hiệu cho một chất phân tích nhất định (phân biệt hoàn toàn) [20].
2.4.2.2 Tính tuyến tính (Linearity)
Tính tuyến tính của một quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả của phƣơng pháp dựa vào đƣờng biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại lƣợng đo đƣợc và nồng độ là một đƣờng thẳng hay trực tiếp tính toán dựa vào tƣơng quan tỉ lệ giữa đại lƣợng đo đƣợc và nồng độ [14,15].
Cả hai trƣờng hợp đều yêu cầu giữa đại lƣợng đo đƣợc và nồng độ phải có sự phụ thuộc tuyến tính. Tính tuyến tính trong một miền giá trị đƣợc xác định bằng hệ số tƣơng quan [14,15].
13
Cách thực hiện:
Tính tuyến tính có thể đƣợc thực hiện trực tiếp trên mẫu chuẩn (bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc) hoặc cân riêng biệt các hỗn hợp tự tạo chứa các thành phần dƣợc chất dựa trên quy trình đặt ra (cách này thƣờng đƣợc dùng để nghiên cứu khoảng phân tích). Tính tuyến tính đƣợc đánh giá bằng cách quan sát đồ thị của tín hiệu ứng với nồng độ hoặc hàm lƣợng của chất phân tích. Nếu có tƣơng quan tuyến tính thì kết quả thử phải đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp thống kê thích hợp, thƣờng bằng cách tính đƣờng hồi quy tuyến tính dựa vào phƣơng pháp bình phƣơng tối thiểu [18].
Để xác định tính tuyến tính cần tiến hành ít nhất 5 nồng độ. Trong những trƣờng hợp khác cần nêu rõ lí do [18].
Giả sử tiến hành thực nghiệm để xác định ứng với các nồng độ x biết trƣớc, các giá trị định lƣợng đƣợc y. Nếu y phụ thuộc tuyến tính vào x, có nghĩa là trong khoảng nồng độ cần khảo sát đƣờng biểu diễn của y theo x là một đƣờng thẳng (đoạn thẳng) theo phƣơng trình sau: y = ax + b
Dựa vào kết quả thu đƣợc từ thực nghiệm của x và y tƣơng ứng ta tính hệ số tƣơng quan r: r = xi - x × y i - y n i=1 ni=1(xi - x)2× ni=1(yi - y)2
Nếu r = 1: có tƣơng quan tuyến tính rõ rệt
r > 0: có tƣơng quan đồng biến r < 0: có tƣơng quan nghịch biến r < 5: không có tƣơng quan tuyến tính r > 5: có phụ thuộc tuyến tính
r = 0: hoàn toàn không có tƣơng quan tuyến tính Tùy theo hoạch định mà chọn giá trị r. Nói chung r phải ≥ 0,99.
2.4.2.3 Độ lặp lại (Repeatability)
Độ lặp lại là mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng lẻ với giá trị trung bình thu đƣợc khi áp dụng phƣơng pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng điều kiện xác định [14-17].
14
Độ lặp lại thƣờng đƣợc thể hiện bằng độ lệch chuẩn (SD) hay độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) của một loạt các lần thử nghiệm [14-17].
Độ lặp lại có thể đƣợc đánh giá trên kết quả của tối thiểu 9 lần định lƣợng trong khoảng nồng độ đã xác định của quy trình (ví dụ 3 nồng độ, mỗi nồng độ đƣợc tiến hành 3 lần) hoặc tối thiểu 6 lần định lƣợng ở nồng độ thử 100% [18]. Sau đó áp dụng công thức tính SD và RSD của phƣơng pháp.
RSD càng nhỏ, phƣơng pháp phân tích càng chính xác, RSD do mỗi phòng thí nghiệm đƣa ra. Thông thƣờng chọn RSD ≤ 2%.
2.4.2.4 Độ đúng (Accuracy)
Độ đúng của một phƣơng pháp phân tích là mức độ sát gần của các giá trị tìm thấy với giá trị thực khi áp dụng quy trình đề xuất trên cùng một mẫu thử đã đƣợc làm đồng nhất trong điều kiện xác định [14-17].
Độ đúng bị ảnh hƣởng bởi sai số hệ thống [14-17].
Độ đúng đƣợc biểu thị bằng tỉ lệ % phục hồi của giá trị thêm vào mẫu thử bằng phƣơng pháp xây dựng.
Cách thực hiện:
Tự tạo hỗn hợp mẫu chứa các thành phần của thành phẩm thuốc mà trong đó có một lƣợng đã biết trƣớc các dƣợc chất cần phân tích đƣợc thêm vào. Trong trƣờng hợp không có đầy đủ các thành phần làm mẫu tự tạo thì có thể chấp nhận cho thêm một lƣợng đã biết của chất cần phân tích vào chế phẩm hoặc so sánh kết quả thu đƣợc với một quy trình chính thống thứ hai có độ đúng đã đƣợc công bố hoặc đã đƣợc xác định [18].
Áp dụng quy trình phân tích đã đề xuất để xác định lƣợng chất cần phân tích có trong mẫu.
Thông thƣờng: 98,0% ≤ tỉ lệ phục hồi ≤ 102,0%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.4.2.5 Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
Giới hạn phát hiện là lƣợng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử còn có thể phát hiện đƣợc nhƣng không nhất thiết có thể định lƣợng đƣợc [18].
Có thể xác định giới hạn phát hiện dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc suy ra đƣợc từ phƣơng trình hồi quy tuyến tính.
15
Giới hạn phát hiện (Limit of Detection = LOD) đƣợc tính theo công thức:
LOD= 3,3 × Độ lệch chuẩn
Độ dốc
2.4.2.6 Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantitation)
Giới hạn định lƣợng là lƣợng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử có thể định lƣợng đƣợc với độ đúng và độ chính xác thích hợp. Giới hạn định lƣợng là một thông số của phép định lƣợng các chất có nồng độ thấp trong mẫu thử, đặc biệt thƣờng đƣợc dùng để xác định tạp chất hoặc sản phẩm phân hủy [18].
Có thể xác định giới hạn định lƣợng dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc suy ra đƣợc từ phƣơng trình hồi quy tuyến tính.
Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantitation = LOQ) đƣợc tính theo công thức:
LOQ = 10 × Độ lệch chuẩn
16
CHƢƠNG 3
PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU