Nguyên tắc: HPLC dựa trên áp lực của bơm cơ học lên một dung môi lỏng
để tải một hỗn hợp chất vào cột hóa học, qua đó quá trình phân tách xảy ra. Một cột phân tách HPLC đƣợc làm đầy bởi các nguyên tử rắn (nhƣ silica gel, polymer hay chất hấp phụ) và hỗn hợp mẫu đƣợc phân tích thành những hợp chất đơn giản hơn sau khi tƣơng tác với các nguyên tử trong cột. Sự phân tách HPLC bị ảnh hƣởng bởi điều kiện của các dung môi lỏng (nhƣ áp suất và nhiệt độ), tƣơng tác hóa học giữa hỗn hợp mẫu và dung môi lỏng (nhƣ tính kỵ nƣớc, quá trình proton hóa,…) và tƣơng tác hóa học giữa các hợp chất mẫu và nguyên tử đặc rắn bên trong cột phân tích (nhƣ ái lực ligand, trao đổi ion,…) [10].
Để thực hiện việc tách một hỗn hợp chất bằng kỹ thuật phân tích HPLC thì cần phải có hệ thống trang bị kỹ thuật này. Thông thƣờng, hệ thống HPLC gồm các bộ phận chính sau: - Bình chứa pha động - Bơm cao áp - Cột sắc ký - Bộ phận tiêm mẫu - Đầu dò (Detector) - Bộ phận ghi nhận tín hiệu
11 2.3.3 Định lƣợng Mometasone furoate bằng HPLC [13] 2.3.3.1 Điều kiện sắc ký - Cột C18 (10 cm 5 mm, 5 m) - Detector: UV - Bƣớc sóng: 238 nm - Nhiệt độ cột: 60ºC - Thể tích tiêm: 20,0 L - Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút
- Pha động: H2O:CH3OH = 45:55, điều chỉnh tỉ lệ nếu cần
2.3.3.2 Chuẩn bị các dung dịch
- Dung dịch thử: phân tán một lƣợng chế phẩm tƣơng ứng 1 mg Mometasone furoate trong 20 mL methanol nóng, thêm 25 mL 2,2,4- trimethylpentane, làm nguội và lắc đều hỗn hợp. Lọc lấy lớp methanol nằm phía dƣới. Lặp lại quy trình trên thêm ít nhất 2 lần với lớp dịch chiết 2,2,4- trimethylpentane, mỗi lần với 10 mL methanol. Thu gom lớp dịch chiết methanol và thêm tiếp methanol cho vừa đủ 50 mL.
- Dung dịch chuẩn: pha dung dịch 0,002% Mometasone furoate chuẩn trong methanol.
Tiến hành tiêm sắc ký lần lƣợt với dung dịch chuẩn và dung dịch thử.
Tính toán hàm lƣợng Mometasone furoate trong chế phẩm dựa vào diện tích peak chính thu đƣợc trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn, dung dịch thử và hàm lƣợng Mometasone furoate trong dung dịch chuẩn.
2.4 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH2.4.1 Tầm quan trọng của việc thẩm định 2.4.1 Tầm quan trọng của việc thẩm định
Thẩm định quy trình phân tích là một quá trình tiến hành thiết lập bằng thực nghiệm các thông số đặc trƣng của phƣơng pháp để chứng minh phƣơng pháp đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến. Nói cách khác, việc thẩm định một quy trình phân tích yêu cầu phải chứng minh một cách khoa học rằng khi tiến hành thí nghiệm các sai số mắc phải là rất nhỏ và chấp nhận đƣợc [14-17].
Việc thẩm định quy trình phân tích là nhằm chứng minh quy trình đó có phù hợp với mục đích ứng dụng không [18].
12
Quy trình phân tích sau khi đƣợc thẩm định có thể đƣa vào các chuyên luận của Dƣợc điển hoặc đƣa vào trong các tiêu chuẩn cơ sở để xin đăng ký lƣu hành [14-17].
2.4.2 Các chỉ tiêu trong thẩm định quy trình phân tích
Để thẩm định một quy trình phân tích dựa vào các chỉ tiêu sau: tính đặc hiệu (specificity), độ chính xác (precision), độ lặp lại (repeatability), độ chính xác trung gian (intermediate precision), độ tái lặp (reproducibility), độ đúng (accuracy), giới hạn phát hiện (limit of detection), giới hạn định lƣợng (limit of quantitation), tính tuyến tính (linearity), khoảng xác định (range) [14-17].
Mục đích của quy trình phân tích phải đƣợc hiểu rõ ràng để quyết định các chỉ tiêu cần đƣợc đánh giá. Thông thƣờng, thẩm định quy trình định lƣợng cần xem xét đánh giá một số chỉ tiêu [18]:
2.4.2.1 Tính đặc hiệu (Specificity)
Tính đặc hiệu hay còn gọi là tính chọn lọc (selectivity) của một quy trình phân tích là khả năng của quy trình cho phép xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích và không bị ảnh hƣởng bởi sự có mặt của các thành phần khác có trong mẫu thử. Thông thƣờng các thành phần này gồm tạp chất, sản phẩm phân hủy, chất nền,…[15-18]
Quy trình dùng để xác định tính đặc hiệu phụ thuộc vào mục tiêu đã định của quy trình phân tích. Không phải lúc nào cũng xác định đƣợc một quy trình phân tích đặc hiệu cho một chất phân tích nhất định (phân biệt hoàn toàn) [20].
2.4.2.2 Tính tuyến tính (Linearity)
Tính tuyến tính của một quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả của phƣơng pháp dựa vào đƣờng biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại lƣợng đo đƣợc và nồng độ là một đƣờng thẳng hay trực tiếp tính toán dựa vào tƣơng quan tỉ lệ giữa đại lƣợng đo đƣợc và nồng độ [14,15].
Cả hai trƣờng hợp đều yêu cầu giữa đại lƣợng đo đƣợc và nồng độ phải có sự phụ thuộc tuyến tính. Tính tuyến tính trong một miền giá trị đƣợc xác định bằng hệ số tƣơng quan [14,15].
13
Cách thực hiện:
Tính tuyến tính có thể đƣợc thực hiện trực tiếp trên mẫu chuẩn (bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc) hoặc cân riêng biệt các hỗn hợp tự tạo chứa các thành phần dƣợc chất dựa trên quy trình đặt ra (cách này thƣờng đƣợc dùng để nghiên cứu khoảng phân tích). Tính tuyến tính đƣợc đánh giá bằng cách quan sát đồ thị của tín hiệu ứng với nồng độ hoặc hàm lƣợng của chất phân tích. Nếu có tƣơng quan tuyến tính thì kết quả thử phải đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp thống kê thích hợp, thƣờng bằng cách tính đƣờng hồi quy tuyến tính dựa vào phƣơng pháp bình phƣơng tối thiểu [18].
Để xác định tính tuyến tính cần tiến hành ít nhất 5 nồng độ. Trong những trƣờng hợp khác cần nêu rõ lí do [18].
Giả sử tiến hành thực nghiệm để xác định ứng với các nồng độ x biết trƣớc, các giá trị định lƣợng đƣợc y. Nếu y phụ thuộc tuyến tính vào x, có nghĩa là trong khoảng nồng độ cần khảo sát đƣờng biểu diễn của y theo x là một đƣờng thẳng (đoạn thẳng) theo phƣơng trình sau: y = ax + b
Dựa vào kết quả thu đƣợc từ thực nghiệm của x và y tƣơng ứng ta tính hệ số tƣơng quan r: r = xi - x × y i - y n i=1 ni=1(xi - x)2× ni=1(yi - y)2
Nếu r = 1: có tƣơng quan tuyến tính rõ rệt
r > 0: có tƣơng quan đồng biến r < 0: có tƣơng quan nghịch biến r < 5: không có tƣơng quan tuyến tính r > 5: có phụ thuộc tuyến tính
r = 0: hoàn toàn không có tƣơng quan tuyến tính Tùy theo hoạch định mà chọn giá trị r. Nói chung r phải ≥ 0,99.
2.4.2.3 Độ lặp lại (Repeatability)
Độ lặp lại là mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng lẻ với giá trị trung bình thu đƣợc khi áp dụng phƣơng pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng điều kiện xác định [14-17].
14
Độ lặp lại thƣờng đƣợc thể hiện bằng độ lệch chuẩn (SD) hay độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) của một loạt các lần thử nghiệm [14-17].
Độ lặp lại có thể đƣợc đánh giá trên kết quả của tối thiểu 9 lần định lƣợng trong khoảng nồng độ đã xác định của quy trình (ví dụ 3 nồng độ, mỗi nồng độ đƣợc tiến hành 3 lần) hoặc tối thiểu 6 lần định lƣợng ở nồng độ thử 100% [18]. Sau đó áp dụng công thức tính SD và RSD của phƣơng pháp.
RSD càng nhỏ, phƣơng pháp phân tích càng chính xác, RSD do mỗi phòng thí nghiệm đƣa ra. Thông thƣờng chọn RSD ≤ 2%.
2.4.2.4 Độ đúng (Accuracy)
Độ đúng của một phƣơng pháp phân tích là mức độ sát gần của các giá trị tìm thấy với giá trị thực khi áp dụng quy trình đề xuất trên cùng một mẫu thử đã đƣợc làm đồng nhất trong điều kiện xác định [14-17].
Độ đúng bị ảnh hƣởng bởi sai số hệ thống [14-17].
Độ đúng đƣợc biểu thị bằng tỉ lệ % phục hồi của giá trị thêm vào mẫu thử bằng phƣơng pháp xây dựng.
Cách thực hiện:
Tự tạo hỗn hợp mẫu chứa các thành phần của thành phẩm thuốc mà trong đó có một lƣợng đã biết trƣớc các dƣợc chất cần phân tích đƣợc thêm vào. Trong trƣờng hợp không có đầy đủ các thành phần làm mẫu tự tạo thì có thể chấp nhận cho thêm một lƣợng đã biết của chất cần phân tích vào chế phẩm hoặc so sánh kết quả thu đƣợc với một quy trình chính thống thứ hai có độ đúng đã đƣợc công bố hoặc đã đƣợc xác định [18].
Áp dụng quy trình phân tích đã đề xuất để xác định lƣợng chất cần phân tích có trong mẫu.
Thông thƣờng: 98,0% ≤ tỉ lệ phục hồi ≤ 102,0%.
2.4.2.5 Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
Giới hạn phát hiện là lƣợng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử còn có thể phát hiện đƣợc nhƣng không nhất thiết có thể định lƣợng đƣợc [18].
Có thể xác định giới hạn phát hiện dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc suy ra đƣợc từ phƣơng trình hồi quy tuyến tính.
15
Giới hạn phát hiện (Limit of Detection = LOD) đƣợc tính theo công thức:
LOD= 3,3 × Độ lệch chuẩn
Độ dốc
2.4.2.6 Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantitation)
Giới hạn định lƣợng là lƣợng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử có thể định lƣợng đƣợc với độ đúng và độ chính xác thích hợp. Giới hạn định lƣợng là một thông số của phép định lƣợng các chất có nồng độ thấp trong mẫu thử, đặc biệt thƣờng đƣợc dùng để xác định tạp chất hoặc sản phẩm phân hủy [18].
Có thể xác định giới hạn định lƣợng dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc suy ra đƣợc từ phƣơng trình hồi quy tuyến tính.
Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantitation = LOQ) đƣợc tính theo công thức:
LOQ = 10 × Độ lệch chuẩn
16
CHƢƠNG 3
PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện
Đề tài đƣợc thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển thuộc công ty Cổ phần xuất nhập khẩu y tế Domesco, từ ngày 05/08/2013 đến ngày 15/10/2013.
3.1.2 Phƣơng tiện thực hiện 3.1.2.1 Thiết bị và dụng cụ 3.1.2.1 Thiết bị và dụng cụ
- Cân phân tích Sartorius CP225D
- Bản mỏng silica gel 60 F254, Merck
- Máy quang phổ hồng ngoại FTIR-8400S, Shimadzu - Phân cực kế tự động ATAGO AP-100
- Máy sắc ký lỏng UFLC, Shimadzu
- Máy đo điểm chảy Electrothermal Model 9100
- Máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis 1700 Pharmaspec, Shimadzu - Bể siêu âm Elma S180H
- Bếp cách thủy Memmert - Tủ sấy Binder
- Buồng soi UV huỳnh quang Camag
- Máy lọc chân không (dùng để lọc pha động)
- Đầu lọc 0,45 m
- Dụng cụ thủy tinh: bình định mức, pipet, buret, bercher, đĩa petri, ống đong, cốc thủy tinh dùng để sấy mẫu (bì)…
17
Hình 3.1 Máy đo điểm chảy Hình 3.2 Phân cực kế tự động
Hình 3.3 Máy quang phổ hồng ngoại Hình 3.4 Máy quang phổ UV-Vis
Hình 3.5 Máy sắc ký lỏng UFLC
18
3.1.2.2 Hóa chất
- Nƣớc lọc RO - Acetone (Macron)
- Methylene chloride (J.T.Baker) - Ethanol 96% (Merck)
- Cồn tuyệt đối (Merck)
- Sulfuric acid đậm đặc (Merck) - Methanol (J.T.Baker)
- Potassium bromide (Merck) - Diethyl ether (Merck) - Acetonitrile (J.T.Baker) - Acetic acid băng (Merck) - 1,2-dichloroethane (Merck)
- Thuốc thử sulfuric acid 20% trong ethanol: lấy 60 mL ethanol 96% cho vào bình định mức 100 mL, cẩn thận thêm từ từ 20 mL sulfuric acid đậm đặc. Để nguội và pha loãng đến vừa đủ với ethanol 96%.
- Mometasone furoate chuẩn, hàm lƣợng 99,46% (Ấn Độ)
3.1.3 Đối tƣợng nghiên cứu
- Mometasone furoate BP/Ph.Eur (nguyên liệu): số lô MF-12025 (JM-01)- 001, sản xuất tại công ty AARTI INDUSTRIES LTD, Ấn Độ.
- Thuốc xịt mũi Nasonex 0,05% sản xuất bởi công ty Schering-Plough, USA với 2 lô: 2KTLD61001 và 1KTLDC1002.
19
3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Kiểm nghiệm nguyên liệu Mometasone furoate
Thực hiện theo dƣợc điển Anh 2012 (BP 2012) và tiêu chuẩn nhà sản xuất cung cấp.
3.2.1.1 Cảm quan
Lấy khoảng 5,000 g mẫu thử (nguyên liệu Mometasone furoate) trải mỏng trên một đĩa petri thủy tinh, quan sát bằng mắt thƣờng.
3.2.1.2 Tính tan
Lấy 4 ống nghiệm sạch khô, đánh dấu thứ tự, lần lƣợt thêm mẫu thử và dung môi hòa tan thích hợp theo Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Chuẩn bị mẫu khảo sát tính tan của Mometasone furoate
Ống nghiệm 1 2 3 4
Khối lƣợng mẫu thử (g) 0,010 1,000 1,000 0,100
Dung môi hòa tan Nƣớc
(100 mL) Acetone (30 mL) Methylene chloride (30 mL) Ethanol 96% (100 mL) Lắc mỗi ống nghiệm trong vài phút. Để yên. Ghi nhận tính tan.
3.2.1.3 Định tính
Phổ hồng ngoại (IR)
- Mẫu chuẩn: nghiền nhỏ khoảng 0,002-0,003 g Mometasone furoate chuẩn với khoảng 0,300-0,400 g potassium bromide khan. Cẩn thận nghiền mịn hỗn hợp, trải đều và dập thành viên. Tiến hành đo và ghi nhận phổ đồ.
- Mẫu thử: nghiền nhỏ khoảng 0,002-0,003 g mẫu thử với khoảng 0,300- 0,400 g potassium bromide khan. Cẩn thận nghiền mịn hỗn hợp, trải đều và dập thành viên. Tiến hành đo và ghi nhận phổ đồ.
20
Sắc ký lớp mỏng
- Dung môi khai triển: H2O:CH3OH:(C2H5)2O:CH2Cl2 = 1,2:8:15:77
- Dung dịch chuẩn và dung dịch thử: pha dung dịch chuẩn và thử ở nồng độ 1 mg/mL trong methylene chloride.
- Tiến hành:
+ Chấm riêng biệt trên bản mỏng 10 L mỗi dung dịch chuẩn và dung
dịch thử. Khai triển bản mỏng trong dung môi khai triển đến khi dung môi đi đƣợc một đoạn khoảng 10 cm. Lấy bản mỏng ra và làm khô trong không khí.
+ Phát hiện A: quan sát dƣới ánh sáng UV 254 nm.
+ Phát hiện B: phun thuốc thử sulfuric acid 20% trong ethanol, nung nóng ở 120ºC trong vòng 10 phút hoặc cho đến khi các vết xuất hiện. Để nguội, quan sát dƣới ánh sáng ban ngày và UV 366 nm.
3.2.1.4 Điểm chảy
Nghiền mẫu thử thành bột mịn (nếu mẫu thử ở dạng tinh thể). Sau đó cho bột vào một ống mao quản, lèn bột bằng cách gõ nhẹ ống mao quản xuống mặt phẳng cứng để có một lớp bột cao 4-6 mm.
Cài đặt nhiệt độ cho máy: nhiệt độ nền: 220ºC, tốc độ gia nhiệt: 1ºC/phút. Khi máy đạt nhiệt độ nền, đặt ống mao quản chứa mẫu thử vào máy. Quan sát và ghi nhận nhiệt độ điểm chảy.
3.2.1.5 Góc quay cực riêng
Cân chính xác 0,250 g mẫu thử cho vào bình định mức 50 mL, hòa tan và pha loãng vừa đủ với cồn tuyệt đối. Lắc đều.
Tiến hành hiệu chỉnh (auto zero) với mẫu trắng là cồn tuyệt đối rồi xác định góc quay cực riêng của mẫu thử.
3.2.1.6 Mất khối lƣợng do làm khô
Sấy khô bì trong tủ sấy ở nhiệt độ 1052ºC trong vòng 30 phút. Lấy ra và để
nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm chứa silica gel. Cân để xác định khối lƣợng bì.
21
dày không quá 10 mm. Đặt bì chứa mẫu vào tủ sấy ở 1052ºC và sấy cho đến khi
khối lƣợng không đổi.
Cân lại để xác định khối lƣợng mẫu bị mất do làm khô. Khối lƣợng mẫu bị mất do làm khô đƣợc tính theo công thức:
(%) = (khối lƣợng bì + khối lƣợng mẫu) – (khối lƣợng bì + mẫu)
khối lƣợng mẫu × 100
3.2.1.7 Định lƣợng
- Mẫu chuẩn: cân chính xác 12,5 mg Mometasone furoate chuẩn cho vào bình định mức 25 mL. Hòa tan và pha loãng vừa đủ với ethanol 96%. Lắc đều. Hút chính xác 2 mL dung dịch này cho vào bình định mức 100 mL và pha loãng vừa đủ với ethanol 96%. Lắc đều.
- Mẫu thử: cân chính xác 50 mg mẫu thử cho vào bình định mức 100 mL. Hòa tan và pha loãng vừa đủ với ethanol 96%. Lắc đều. Hút chính xác 2 mL dung dịch này cho vào bình định mức 100 mL và pha loãng vừa đủ với ethanol 96%. Lắc đều.
- Tiến hành đo độ hấp thụ của mẫu chuẩn và mẫu thử ở bƣớc sóng 249 nm. Thực hiện trong cùng điều kiện với mẫu trắng là ethanol 96%.
Hàm lƣợng Mometasone furoate trong mẫu thử đƣợc tính theo công thức:
% Mometasone furoate = AT × mC (tinh khiết) × 100 × 100
AC × mT × 25
Trong đó: AT là độ hấp thụ của mẫu thử tại bƣớc sóng 249 nm