Tủ ấm CO2, tủ sấy, tủ lạnh, autoclave, ống đong, ống hỳt, lame, kớnh hiển vi, kẹp, dao, kộo, que cấy, găng tay, đốn cồn, tỳi nilong, tõm bụng vụ trựng, thựng đỏ, bỡnh yếm khớ, tỳi tạo mụi trƣờng yếm khớ (Anaerocult C)...
3.2.3 Húa chất và mụi trường
Húa chất: mỏu cừu (Cụng ty Nam Khoa), cồn 960, cồn 700, oxy già, nƣớc cất, dầu ceda, Crystal violet, Lugol, Safranine,...
Bộ kit API 20A: dựng kiểm tra đặc tớnh sinh húa trong hệ thống định danh cỏc vi khuẩn yếm khớ (Bio-Mộrieux, Phỏp).
Mụi trường:
Mụi trƣờng Blood Agar. Mụi trƣờng Pepton Water.
22
Mụi trƣờng MHA (Mueller Hinton Agar). Mụi trƣờng CMM (Cooked Meat Medium).
3.3 Phƣơng phỏp tiến hành thớ nghiệm
3.3.1 Phương phỏp lấy mẫu
Tiến hành thu thập cỏc mẫu vịt bệnh cú triệu chứng liệt chõn, liệt cỏnh, liệt cổ, tiờu chảy hay chết để mổ khỏm lấy mẫu ruột kiểm tra.
Hỡnh 3: Thu thập cỏc mẫu vịt bị bệnh “cỳm cần”
Nội dung tiến hành gồm:
Quan sỏt, ghi nhận dấu hiệu bờn ngoài của vịt bệnh và ghi vào phiếu lấy mẫu (bao gồm cỏc triệu chứng: liệt chõn, liệt cỏnh, liệt cổ, tiờu chảy và cỏc triệu chứng khỏc nếu cú).
Giết vịt bằng cỏch cắt cổ hay hủy tủy.
Đặt vịt nằm ngữa, dựng kộo cắt vựng sỏt hậu mụn, cắt cơ ở xoang bụng, sau đú cắt lờn hai bờn sƣờn để mở xoang bụng và ngực.
Kiểm tra tổng quỏt cỏc cơ quan, tiếp tục ghi nhận vào phiếu lấy mẫu, sau đú tiến hành lấy mẫu ruột.
Dựng dõy thun buộc hai đầu đoạn ruột: phớa trờn giỏp với mề, phớa dƣới giỏp với lỗ huyệt. Dựng kộo cắt rời đoạn ruột đó đƣợc buộc dõy thun, sỏt trựng bằng cồn 700
, rồi cho vào tỳi nilong vụ trựng và đuổi oxy.
23
3.3.2 Phương phỏp nuụi cấy phõn lập
Mẫu ruột đƣợc đem về phũng thớ nghiệm và tiến hành phõn lập.
Dựng kộo cắt mở ruột để lấy đƣợc chất chứa, lấy tõm bụng vụ trựng nhỳng vào chất chứa trong mẫu ruột. Tiến hành cấy mẫu vào thạch mỏu.
Hỡnh 6: Mụi trƣờng đƣợc chuẩn bị để phõn lập vi khuẩn
Chuyển vào tủ ấm CO2 với tỷ lệ 10% CO2 ở 370C trong 24-48 giờ.
Hỡnh 7: Tủ ấm CO2 để nuụi cấy cỏc vi khuẩn yếm khớ Hỡnh 4: Mẫu ruột đƣợc bảo quản
tỳi nilong và đuổi khớ oxy
Hỡnh 5: Mẫu ruột đƣợc chuẩn bị nuụi cấy phõn lập
24
Chọn những khuẩn lạc nhày, khụ và cú dung huyết bờta rất rừ khi nhỡn qua thạch (Public Health England, 2014). Tiếp tục ria cấy cỏc khuẩn lạc điển hỡnh nghi ngờ của vi khuẩn Clostridium spp. lờn thạch mỏu và ủ trong tủ ấm CO2, với tỷ lệ 10% CO2 ở 370C trong 24-48 giờ, mục đớch để cú đƣợc nhiều khuẩn lạc thuần: rời, rừ và điển hỡnh để tiến hành định danh phõn loại.
Tiến hành định danh cỏc chủng vi khuẩn Clostridium bằng phản cỏc ứng sinh húa với test API 20A (Bio-Mộrieux, Phỏp) (Trần Linh Thƣớc, 2010; Kouassi, 2014), kết hợp với kết quả về 4 đặc tớnh khỏc đó đƣợc kiểm tra bao gồm: bắt màu Gram dƣơng, hỡnh que, cú khả năng hỡnh thành nha bào và phản ứng sinh catalate của vi khuẩn Clostridium spp.
Cuối cựng tiến hành giữ giống vi khuẩn trong mụi trƣờng CMM.
Hỡnh 10: Mụi trƣờng CMM để giữ giống vi khuẩn Hỡnh 8: Khuẩn lạc vi khuẩn dung
huyết trờn thạc mỏu Hỡnh 9: Khuẩn lạc vi khuẩn trờn thạch mỏu Mụi trƣờng CMM chuẩn bị Mụi trƣờng CMM đó giữ giống
25
3.3.3 Kiểm tra đặc tớnh sinh húa của vi khuẩn Clostridium spp. phõn lập được Phương phỏp kiểm tra hỡnh thỏi dưới kớnh hiển vi quang học: Làm tiờu bản Phương phỏp kiểm tra hỡnh thỏi dưới kớnh hiển vi quang học: Làm tiờu bản và nhuộn Gram, xem dƣới kớnh hiển vi điện quang học ở vật kớnh 100.
Hỡnh 11: Vi khuẩn Clostridium spp. dƣới kớnh hiển vi quang học ở vật kớnh 100
Hỡnh 12: Bào tử vi khuẩn đƣợc xem dƣới kớnh hiểm vi quang học ở vật kớnh 100
Kiểm tra phản ứng sinh catalates của vi khuẩn
26
Kiểm tra chỉ tiờu sinh húa bằng phản ứng sinh húa với bộ kit API 20A: Sau khi ria cấy cỏc khuẩn lạc nghi ngờ của cỏc chủng vi khuẩn Clostridium
trờn thạch mỏu, ta chọn những khuẩn lạc thuần. Tiến hành kiểm tra và đọc kết cỏc đặc tớnh quả sinh húa trong bộ kit API 20A theo bảng định danh vi khuẩn yếm khớ (Bio-Mộrieux, Phỏp).
Hỡnh 14: Kết quả sinh húa trong bộ kit API 20A
3.3.4 Phương phỏp kiểm tra độ nhạy cảm của vi khuẩn Clostridium spp. phõn lập được với khỏng sinh
Sử dụng phƣơng phỏp khuếch tỏn trờn đĩa thạch của Bauer và ctv (1966), dựa trờn đƣờng kớnh vũng vụ khuẩn.
Bảng 7: Đỏnh giỏ mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với một số loại khỏng sinh
STT Loại khỏng sinh Hàm lƣợng Đƣờng kớnh vũng vụ khuẩn (mm) Khỏng thuốc Mẫn cảm trung bỡnh Mẫn cảm cao 1 Trimethoprime/ Sulfamethoxazol 1.25/23,75μg ≤10 11-15 ≥16 2 Penicillin 10UI ≤14 ≥15 3 Tetracycline 30μg ≤14 15-18 ≥19 4 Erythromycin 15μg ≤13 14-22 ≥23 5 Norfloxacin 10μg ≤12 13-16 ≥17
Mụi trường làm khỏng sinh đồ: Là mụi trƣờng MHA (Mueller Hinton Agar), pH của mụi trƣờng phải là 7,2-7,6. Mụi trƣờng đƣợc khử trựng hấp ƣớt ở 1210C trong 15 phỳt. Để nguội 600C rồi đổ ra đĩa petri sao cho bề dày của thạch khoảng 4mm.
Vi khuẩn thớ nghiệm: Chuẩn bị canh trựng cú độ đục tƣơng đƣơng ống MacFarland 0,5%.
Phương phỏp thực hiện khỏng sinh đồ: Dựng tăm bụng vụ trựng nhỳng vào canh trựng đó chuẩn bị, ộp hết nƣớc trờn thành ống nghiệm, trải đều vi khuẩn lờn mặt thạch MHA. Chờ cho mặt thạch khụ dựng kẹp vụ trựng gắp cỏc đĩa khỏng sinh đặt lờn mặt thạch, đĩa cỏch nhau 2,5-3,5 cm và cỏch rỡa đĩa thạch 2 cm. Đĩa đƣợc ủ trong tủ ấm CO2 với tỉ lệ 10% CO2 ở 370C trong 24 giờ và đọc kết quả.
27
Đọc kết quả bằng cỏch đo đƣờng kớnh vũng vụ khuẩn, rồi so sỏnh theo bảng tiờu chuẩn (bảng 7) để đỏnh giỏ mức độ nhạy của vi khuẩn với một số loại khỏng sinh.
3.4 Phƣơng phỏp xử lý số liệu
Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Excel và Minitab 16.0. Phộp thử Chi-square đƣợc dựng để so sỏnh cỏc tỷ lệ vi khuẩn Clostridium spp. phõn lập đƣợc.
28
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Tổng quan về địa điểm lấy mẫu
Hỡnh 15: Địa điểm lấy mẫu tại một số tỉnh ĐBSCL
Thời gian lấy mẫu đƣợc tiến hành trong khoảng kết thỳc vụ lỳa Hố - Thu, là khoảng thời gian hoạt động nuụi vịt chạy đồng diễn ra mạnh mẽ. Mẫu vịt đƣợc lấy tại cỏc liều tạm hay nụng hộ của chủ chăn nuụi, địa điểm lấy mẫu đƣợc chia làm hai khu vực chớnh: tỉnh An Giang và Tỉnh khỏc (bao gồm cỏc tỉnh: Bến Tre, Cần Thơ, Đồng Thỏp, Hậu Giang, Kiờn Giang, Long An, và Vĩnh Long).
29
Địa bàn lấy mẫu là tỉnh ở miền Tõy Nam Bộ, thuộc vựng Đồng bằng sụng Cửu Long, đõy vựng cú thế mạnh về phỏt triển nụng nghiệp, với hơn 90% diện tớch đất trồng lỳa nƣớc. Là vựng hạ lƣu của sụng Mờ Kụng, với hai nhỏnh sụng chớnh là sụng Tiền và sụng Hậu, cựng với cỏc hệ thống sụng khỏc tạo cho vựng cú mạng lƣới sụng ngũi, kờnh, gạch dày đặc và phong phỳ. Địa hỡnh đa dạng với nhiều nhúm đất, trong đú đất phự sa và đất phốn chiếm hơn 70% diện tớch đất khu vực. Nằm trong vựng khớ hậu nhiệt dới giú mựa nờn vựng cú hai mựa rừ rệt là: mựa mƣa và mựa khụ (http://vi.wikipedia.org).
Khu vực là nơi cú hoạt động chăn nuụi vịt chạy đồng trờn cỏc đồng lỳa sau thu hoạch phỏt triển mạnh. Tại An Giang với quy hoạch “cỏnh đồng mẫu lớn”, hệ thống đờ bao ngăn lũ khộp kớn tạo điều kiện phỏt triển cỏc vựng sản xuất lỳa, nếp cao sản của tỉnh, và truyền thống chăn nuụi vịt chạy đồng với số lƣợng lớn, quy mụ khu vực đó phỏt huy đƣợc thế mạnh nụng nghiệp của khu vực (http://www.angiang.gov.vn) . Riờng cỏc tỉnh khỏc vẫn phỏt triển hỡnh thức chăn nuụi này nhƣng số lƣợng ớt, chăn nuụi nhỏ lẻ, chủ yếu là tự phỏt trong tỉnh nờn việc quản lý cũn rất hạn chế.
Vịt đƣợc chăn thả trờn chủ yếu trờn cỏc cỏnh đồng sau khi thu hoạch, với nguồn thức ăn là: lỳa, ốc, cụn trựng, cỏc loài giỏp xỏc, động vật thủy sinh, rau xanh,...(Bựi Xuõn Mến, 2000; Nguyễn Thiện và ctv, 2005). Cỏc chủ hộ chăn nuụi vẫn phải kết hợp cho vịt ăn thờm thức ăn hỗn hợp của cỏc cụng ty: Sunjin, Master, CP,...trong chạy đồng nhằm ổn định khẩu phần ăn, tăng khả năng sản xuất trứng-thịt của vịt. Theo tài liệu của Lõm Minh Thuận và Chế Minh Hựng (2004) cho biết: với 3-5% lƣợng lỳa rơi vói sau mỗi vụ thu hoạch và cỏc nguồn thức ăn tự nhiờn khỏc, khi nuụi vịt chạy đồng này đó giảm thiểu đƣợc từ 30-40% lƣợng thức ăn hỗn hợp cung cấp. Về chuồng nuụi đƣợc quõy tạm tại nơi chạy đồng, đƣợc lút rơm dày cho vịt để ủ ấm, nghỉ ngơi và đẻ trứng.
30
4.2 Kết quả phõn lập vi khuẩn Clostridium spp.
4.2.1 Tỷ lệ vịt bệnh nhiễm vi khuẩn Clostridium spp.
Tỷ lệ vịt bệnh nhiễm vi khuẩn Clostridium spp. từ mẫu ruột đƣợc trỡnh bày trong bảng 8.
Bảng 8: Tỷ lệ vịt bệnh nhiễm vi khuẩn Clostridium spp. từ mẫu ruột
Địa phƣơng
Ruột Vịt
Số mẫu xột nghiệm Số mẫu dƣơng tớnh Tỷ lệ (%)
An Giang 37 20 54,05a
Tỉnh Khỏc 47 26 55,32a
Tổng cộng 84 46 54,76
Ghi chỳ: Những giỏ trị trong cựng một cột mang số mũ giống nhau thỡ khỏc nhau khụng cú ý nghĩa (P>0,05)
Từ kết quả ở bảng 8 cho thấy: trong tổng số 84 mẫu ruột thu thập đƣợc từ vịt cú triệu chứng liệt chõn, liệt cỏnh, liệt cổ, tiờu chảy và chết tại một số tỉnh ĐBSCL, cú 46 mẫu dƣơng tớnh với vi khuẩn Clostridium spp. chiếm tỷ lệ 54,76%. Tỷ lệ vịt bệnh nhiễm vi khuẩn là rất cao, kết quả gõy bệnh trờn vịt và sự hiện diện của vi khuẩn Clostridium spp. là phự hợp với nghiờn cứu của Vidal và ctv (2013); Cooper và ctv (2013).
Theo Markey và ctv (2013); Todar (2006), vi khuẩn Clostridium spp. khụng chỉ ảnh hƣởng trực tiếp đến mụ bào mà cũn khả năng sản sinh một hay nhiều loại độc tố với độc lực khỏc nhau gõy hại vật chủ, đú chớnh là nguyờn nhõn chớnh gõy bệnh và gõy chết vịt. Khi vịt bệnh ở thể mang trựng, vi khuẩn Clostridium spp.
đƣợc phỏt hiện trong phõn vật chủ (Haagsma, 1991), đõy là nguồn phỏt tỏn bệnh đầu tiờn đƣợc biết đến, dẫn đến tỷ lệ nhiễm cao của vi khuẩn Clostridium spp.
Ngoài ra, mầm bệnh (vi khuẩn hay độc tố của vi khuẩn) cũn đƣợc phỏt hiện trong xỏc chết của vật chủ, vi khuẩn Clostridium spp. tham gia vào quỏ trỡnh phõn hủy xỏc chết, tạo một mụi trƣờng chất nền giàu protein và kỵ khớ (Defilippo và ctv, 2013), vi khuẩn phỏt triển và sản sinh độc tố vào mụi trƣờng, đến cỏc yếu tố truyền lõy (Wobeser, 1997) gõy bệnh cho loài vật cảm nhiễm.
Nguyờn nhõn quan trọng nhất tỏc động đến kết quả nhiễm vi khuẩn
Clostridium spp. rất cao ở vịt đú là mụi trƣờng. Mụi trƣờng tự nhiờn luụn tạo điều kiện thuận lợi cho chăn nuụi vịt chạy đồng phỏt triển tại khu vực ĐBSCL, nhƣng bờn cạnh đú vi khuẩn Clostridium spp. lại tồn tại đa dạng và phõn bố khắp nơi trong mụi trƣờng. Theo Haagsma (1991) vi khuẩn Clostridium spp. hiện diện phong phỳ trong đất, bào tử của vi khuẩn cú thể tồn tại trong thời gian dài và gõy
31
bệnh cho cỏc loài vật cảm nhiễm qua vết thƣơng hay qua đƣờng tiờu húa. Tại cỏc vựng đất trầm tớch, đầm lầy, ngập nƣớc thƣờng xuyờn đƣợc ghi nhận với sự hiện diện cao của vi khuẩn Clostridium (Wobeser và ctv 1987), cỏc điều kiện này phự hợp với cỏc khu vực chăn nuụi vịt chạy đồng tại ĐBSCL. Thúi quen cày xới đất sau thu hoạch để tiếp tục vụ mới, khi đú rơm rạ, cỏc loài động vật khụng xƣơng sống, cỏc loài thực vật khỏc lại bị vựi lấp vào trong đất, phõn hủy và tạo lớp chất hữu cơ cao (Vidal và ctv, 2013) thuận lợi cho sự phỏt triển của vi khuẩn. Cuối cựng với tập tớnh quan trọng của vịt là sục bựn để tỡm thức ăn (Bựi Xuõn Mến, 2000; Lõm Minh Thuận và Chế Minh Hựng, 2004) khi chăn thả trờn đồng ruộng tạo nguy cơ cao để bựng phỏt dịch bệnh. Vỡ vậy, tỷ lệ nhiễm vi khuẩn
Clostridium spp. cao ở vịt chạy đồng theo kết quả phõn lập trờn là phự hợp. Tỷ lệ vịt bệnh nhiễm cao vi khuẩn Clostridium spp. cũn do cỏc yếu tố truyền lõy, đõy là yếu tố quyết định tỷ lệ nhiễm của vật chủ, sự bựng phỏt ngộ độc tại khu vực và phỏt tỏn từ khu vực này sang khu vực khỏc. Theo Espelund và Klaveness (2014) yếu tố truyền lõy của vi khuẩn Clostridium bao gồm: tảo, thực vật, động vật khụng xƣơng sống. Nghiờn cứu này rất phự hợp với đặc điểm tại cỏc vựng ao, hồ, đầm nƣớc lớn tại nƣớc ta (Nguyễn Thiện và ctv, 2005), đó ghi nhận hệ sinh vật phự du sinh vật phong phỳ, trong đú phự du thực vật gồm 7 loại là: thanh tảo, tảo lục, tảo khảo, tảo giỏp, tảo trần, tảo vàng và tảo vàng ỏnh, trong đú tảo lục và tảo khảo phỏt triển mạnh (Chun và ctv, 2013). Theo Vidal và ctv
(2013) ruồi là nhõn tố đúng vai trũ quan trọng trong việc phỏt tỏn vi khuẩn
Clostridiu trong cỏc ổ dịch, song song đú ruồi cũn đẻ trứng vào xỏc cỏc động vật chết trong mụi trƣờng, khi phỏt triển thành giũi lại mang độc tố tiếp tục gõy bệnh cho loài vật cảm nhiễm, làm cho tỡnh hỡnh ngộ độc thờm trầm trọng (Locke và Friend, 1989; Rocke và Friend, 1998; Rocke, 2006). Tổng hợp cỏc yếu tố truyền lõy trờn, khi vịt bệnh nhiễm vi khuẩn Clostridium spp. với tỷ lệ rất cao là phự hợp, bờn cạnh đú sẽ đƣa ra những dự bỏo về tỡnh hỡnh ngộ độc lớn và nhiều ổ dịch khỏc trong tƣơng lai.
Tại hai địa điểm nghiờn cứu của ĐBSCL là An Giang và một số Tỉnh Khỏc đó ghi nhận đƣợc tỷ lệ vịt bệnh nhiễm vi khuẩn Clostridium spp. rất cao với tỷ lệ lần lƣợt là: 54,05% và 55,32%. Kết quả phõn lập vi khuẩn Clostridium spp. tại An Giang thỡ thấp hơn so với một số Tỉnh Khỏc, tuy nhiờn sự khỏc biệt này khụng cú ý nghĩa thống kờ (P=0,908). Dựa vào kết quả trờn cho ta thấy: tỷ lệ vịt bệnh nhiễm vi khuẩn Clostridium spp. rất cao tại một số khu vực của ĐBSCL, điều này càng khẳng định khả năng gõy bệnh, phõn bố trong mụi trƣờng của vi khuẩn Clostridium spp. sẽ ngày càng cao và đa đạng.
4.2.2 Tỷ lệ vịt bệnh nhiễm cỏc chủng vi khuẩn Clostridium
Tiếp tục xỏc định vai trũ của từng chủng vi khuẩn trong nhúm Clostridium spp. gõy bệnh trờn vịt và kết quả thu đƣợc trỡnh bày trong bảng 9.
32
Bảng 9: Kết quả xỏc định vịt bệnh nhiễm cỏc chủng Clostridium bằng phản ứng sinh húa
Chủng Clostridium
Ruột Vịt
Số mẫu xột nghiệm Số mẫu dƣơng tớnh Tỷ lệ (%)
C. botulinum 84 18 21,43 C. difficile 84 2 2,38 C. perfringens 84 1 1,19 C. colinum 84 25 29,76 0 5 10 15 20 25 30
Theo bảng 9, kết quả phõn lập cỏc chủng vi khuẩn Clostridium rất đa dạng, kết quả đó ghi nhận cú đến bốn chủng vi khuẩn Clostridium phõn lập đƣơc từ mẫu ruột vịt bệnh tại một số tỉnh ĐBSCL. Trong đú, cỏc mẫu ruột vịt bệnh nhiễm vi khuẩn C. colinum với tỷ lệ cao nhất là 29,76%, tiếp đến là C. botulinum là 21,43%, C. difficile là 2,38% và nhiễm thấp nhất C. perfringens với tỷ lệ 1,19%.
Kết quả phõn lập trong bảng 9 với sự hiện diện của vi khuẩn C. botulinum
trong cỏc mẫu ruột vịt bệnh là phự hợp với nghiờn cứu của Locke và Friend (1989); Rocke và Friend (1998) về nguyờn nhõn gõy bệnh “limberneck” trờn vịt. Theo Espelund và Klaveness (2014), tại cỏc vựng xảy ra ngộ độc đó hỡnh thành “vũng sinh thỏi” khộp kớn của vi khuẩn C. botulinum trong mụi trƣờng, trong đú vi khuẩn đó tham gia vào chuỗi thức ăn (Defilippo và ctv, 2013; Espelund và Klaveness, 2014) của động vật để gõy ngộ độc cho cỏc loài vật cảm nhiễm, vỡ
Hỡnh 16: Kết quả phõn lập cỏc chủng Clostridium bằng phản ứng sinh húa
C. colinum Tỷ lệ (%) 29,76 21,43 2,38 1,19
33
vậy khi xảy ra ngộ độc việc ghi nhận sự hiện diện khỏ cao của vi khuẩn C.