D. Độ lặp lại của phương pháp
2. Phương pháp thử
a. Cảm quan: Kiểm tra thể chất, màu sắc, mùi, vị theo Phụ lục 1.1 - DĐVN IV, cao phải đạt yêu cầu đã nêu. phải đạt yêu cầu đã nêu.
b. Độ đồng nhất; độ tan: Thử theo Phụ lục 1.1. – DĐVN IV.
c. Mất khối lượng do làm khô: Cân chính xác khoảng 1g cao cho vào chén sứ, sấy đến khối lượng không đổi, tính hảm ẩm trong cao theo công thức: đến khối lượng không đổi, tính hảm ẩm trong cao theo công thức:
Hàm ẩm (%) =
Khối lượng ban đầu – Khối lượng sau khi sấy
x 100 Khối lượng ban đầu
d. Xác định chất chiết được bằng nước trong cao: Thử theo phương pháp chiết nóng, Phụ lục 12.10 – DĐVN IV. Phụ lục 12.10 – DĐVN IV.
e. pH của dung dịch cao đã pha loãng thành nồng độ 1%: Thử theo Phụ lục 6.2 – DĐVN IV. DĐVN IV.
f. Tro toàn phần: Thử theo phương pháp 1, Phụ lục 9.8 – DĐVN IV
g. Định tính các nhóm chất có trong cao: Theo phương pháp hóa thục vật thường quy. quy.
h. Giới hạn kim loại nặng: Không quá 20 ppm
- Dung dịch thử: Lấy 1 g cao đặc, tiến hành như phương pháp 3, Phụ lục 9.4.8 – DĐVN IV.
- Dung dịch chì mẫu 1 ppm: Lấy 1 ml dung dịch chì mẫu 20 ppm và tiếnhành như phương pháp 3, Phụ lục 9.4.8 – DĐVN IV.
i. Giới hạn nhiễm khuẩn: Thử theo Phụ lục 13.6 – DĐVN IV.
j. Định tính sự có mặt các vị thuốc trong cao thuốc bằng SKLM:
Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: Cân số gam dược liệu đã được tán nhỏ thành bột tương ứng có trong 1 g cao đặc.
- Bá bệnh; Ba kích; Cốt khí củ 0,33 g - Đương quy; Hoàng kỳ 0,46 g - Xà sàng tử; Bạch tật lê 0,40 g
- Câu kỷ tử 0,53 g
- Cho riêng mỗi vị dược liệu vào bình nón, ngâm trong ethanol 96%, 3 lần, mỗi lần 10ml trong 1 giờ, gạn lấy dịch, lọc, lấy dịch lọc đem bốc hơi dung môi còn 1 ml để chấm sắc ký của từng vị dược liệu.
- Lấy 1g cao đặc, ngâm trong 30ml ethanol 96% trong 3 giờ, lọc, lấy dịch lọc đem bốc hơi dung môi còn 2-3 ml, được dịch chấm sắc ký của cao đặc.
- Bản mỏng Silicagel GF254, hoạt hóa ở 1050C trong 1 giờ.
- Hệ dung môi triển khai: Mỗi vị dược liệu tiến hành khảo sát trên nhiều hệ dung môi, chon hệ tách vết rõ, có khả năng nhận biết được vị thuốc trong cao đặc bài thuốc để ghi lại kết quả.
- Triển khai sắc ký: Chấm riêng 2 dịch chiết dược liệu và cao đặc trên cùng một bản mỏng với cùng một thể tích 10µl, để khô, chạy sắc ký đến vạch giới hạn dung môi (cách mép trên 0,5cm), lấy ra, để khô ở nhiệt độ phòng. Hiện vết dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm.
- Hệ dung môi: (có thể điều chỉnh tỷ lệ nếu cần) Bá bệnh: Cloroform : ethylacetat (7:3) Bạch tật lê: Cloroform : methanol (19:1) Xà sàng tử: Cloroform : ethylacetat (9:1)
Đương quy: Cyclohexan : ethylacetat : aceton (7:2:1) Hoàng kỳ: Cloroform : methanol (19:1)
Cốt khí củ: Toluen : chloroform : aceton (4:2,5:3,5)
Câu kỷ tử: Toluen : ethylacetat : aceton : acid formic (5:2:2:1) Ba kích: Toluen : ethylacetat : acid formic (8:2:0,1)
- Yêu cầu : Sắc ký đồ của cao đặc phải có các vết (2 đến 3 vết) cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của vị dược liệu.
k. Định lượng: Tiến hành theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Điều kiện sắc ký: Điều kiện sắc ký:
- Pha tĩnh: Cột Zorbax XDB-C18 (250 mm x 4.6 mm x 5µm). - Tốc độ dòng: 0.5 ml/phút
- Thể tích tiêm: 10 μl.
- Bước sóng phát hiện: 305 nm.
- Pha động: acetonitrile - acid phosphoric 0.1%, rửa giải theo chương trình sau: Thời gian (phút) Acetonitril (%) Acid phosphoric (%)
0 0 100
10-80 2-20 98-80
80-100 20-30 80-70
100-130 30-60 70-40
130-145 60-100 40-0
Mẫu thử: Cân chính xác 30,0 mg cao, hòa tan trong 1 ml methanol 40%, siêu âm 10 phút cho tan hoàn toàn. Lọc qua màng lọc kích cỡ 0.45 μm, thu được dung dịch có nồng độ 30 mg/ml.
Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 1,25 mg chất chuẩn Osthole, và 1,25 mg chất chuẩn Imperatorin hòa tan trong 10,0 ml methanol, siêu âm 10 phút cho tan hoàn toàn, lọc qua màng lọc kích thước 0.45 μm thu được dung dịch chuẩn Osthole và Imperatorincó cùng nồng độ 125 μg/ml.
Tiêm riêng biệt các mẫu chuẩn, tiến hành sắc ký, ghi nhận thời gian lưu và diện tích pic của các pic chuẩn. Thiết lập đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ chất chuẩn: Y= aX+b.
Tiêm dung dịch thử, ghi nhận sắc ký đồ, xác định pic có cùng thời gian lưu với pic chuẩn. Nồng độ chất chuẩn trong dung dịch được xác định dựa trên công thức:
C = S - b x H (µg/ml) a
Trong đó:
C (µg/ml): nồng độ chất chuẩn trong dung dịch thử S: diện tích pic
a,b: các hệ số của phương trình đường chuẩn, xác định bằng thực nghiệm. H: độ tinh khiết của chất chuẩn
Yêu cầu: RSD ≤ 2%.
Hàm lượng tính theo % các chất trong cao đặc được xác định dựa trên công thức:
X (%) = C x 1000 30000.10
2. Đóng gói, bảo quản
Đóng trong bao bì chống ẩm, để nơi khô mát, tránh ánh sáng.
Ngày tháng năm 20 (Đã ký)