3.4.2.1. Các vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu
Vi sinh vật kiểm định: + Candida albicans (Ca) +Saccharomyces cerevisiae (Sa) Chất đối chứng: Fluconazol: 500 µg/ml.
3.4.2.2. Môi trường thử nghiệm
Thành . phần MT Glucose (%) Pepton (%) Thạch (%) Nước pH Sabouraud
nuôi cấy 2,0 1,0 0 Vừa đủ
100ml 7,0÷ 7,4 Sabouraud thử
nghiệm 2,0 1,0 1,6
3.4.2.3. Nguyên tắc
Nguyên tắc tương tự phép thử kháng khuẩn.
3.4.2.4. Tiến hành
- Tiến hành tương tự với phương pháp kháng khuẩn. Một số chú ý trong phép thử kháng nấm:
+ Mẫu thử được pha vào EtOH với nồng độ 500 µg/ml.
+ Nấm kiểm định nuôi cấy trong tủ ấm 28÷ 300C, thời gian 18÷ 24h.
+ Các đĩa petri có mẫu thử được đặt trong tủ ấm ở t0= 28÷ 300C, trong 24÷ 48h, rồi sau đó lấy ra đọc kết quả, đo đường kính vòng vô nấm nếu có.
- Đánh giá kết quả: dựa trên đường kính vòng vô nấm và được đánh giá theo công thức: 2 1 1 ( ) 1 n n i i i i D D D D s n n
D: Đường kính trung bình vòng vô nấm (mm)
i
D
: Đường kính vòng vô nấm thứ is: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh n: số thí nghiệm làm song song (n= 4).
Bảng 3.14. Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm
1 2 3a 3b 4a 4b Peni Strep Flu
Bc - - - 9.16 ±0,20 - - 16,77 ± 2,46 Bs - - - 20,36 ±1,51 Bp - - - 12,48 ±0,28 SL - - - - Sal - - - 10,81 ±0,91 EC - - - 8,01 ±0,19 Shi - - - 12,01 ±0,68 Pro - - - 18,76 ±0,70 Pseu - - - 10,53 ±0,31 Sta - - - 18,03 ±1,74 Ca - - - - Sa - - - -
Chú thích: Peni: penicillin; Strep: streptomycin; (-): không có tác dụng Đường kính vòng vô khuẩn: đơn vị mm.
Kết luận: Mẫu thử 3b có tác dụng với 1 vi khuẩn thử. 3.5. Bàn luận
3.5.1. Về các phản ứng tổng hợp hóa học
Qua quá trình thực nghiệm, chúng tôi có nhận xét như sau:
1) Phản ứng đóng vòng tổng hợp acid 2-amino-4-(1H-benzo[d]imidazol-2-yl)- butyric: từ nguyên liệu ban đầu là o-phenylendiamin và acid glutamic cho hiệu suất tốt (84-86%). Cơ chế của phản ứng diễn ra như sau:
Hình 3.7: Cơ chế phản ứng đóng vòng tạo chất 1
Các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất phản ứng:
Nhiệt độ: Nhiệt độ tối ưu cho phản ứng là nhiệt độ sôi của hỗn hợp trong bình phản ứng tạo ra quá trình hồi lưu. Nhiệt độ thấp, không đủ xảy ra quá trình sôi, phản ứng xảy ra không hoàn toàn.
Khuấy trộn đều trong quá trình phản ứng giúp phản ứng xảy ra tốt hơn và
tránh hiện tượng quá nhiệt cục bộ.
Quá trình xử lý sản phẩm, khi chiết với diethylether để loại o- phenylendiamin dư cần thao tác nhanh vì ở pH 8 sản phẩm dễ kết tủa.
2) Phản ứng nitro hóa sử dụng tác nhân sulfo-nitric
Nitro hóa chất 1 để tạo chất 2 xảy ra theo cơ chế thế ái điện tử (SE). Tác nhân ái điện tử NO2+ được sinh ra theo phương trình sau: [4]
HNO3 + 2H2SO4 → NO2+ 2HSO4- + H3O+
Sau khi được tạo ra, ion nitroni NO2+ tấn công vào nhân thơm theo cơ chế thế ái điện tử chung. Phản ứng nitro hóa xảy ra theo hai giai đoạn, giai đoạn tạo phức là giai đoạn chậm, quyết định tốc độ phản ứng:
Các yếu tố ảnh hưởng tới phản ứng:
Nhiệt độ: phản ứng tiến hành thuận lợi ở nhiệt độ từ 5-100C. Nhiệt độ làm tăng tốc độ phản ứng nhưng cũng đồng thời làm tăng tốc độ phản ứng oxy hóa nên sinh ra nhiều tạp. Trong quá trình phản ứng, dùng nước đá làm lạnh bên ngoài bình cầu. Khuấy trộn đều giúp tránh gây quá nhiệt cục bộ (do phản ứng tỏa nhiều nhiệt). Acid H2SO4 là xúc tác tạo ion nitroni, tạo môi trường cho phản ứng và ngăn acid HNO3 phân ly thành H+ và NO3-. Ngoài ra, acid H2SO4 đặc còn có vai trò hút nước trong môi trường và nước sinh ra trong phản ứng nên làm tăng tốc độ phản ứng nitro hóa.
Khả năng phản ứng của chất 1 là không cao nên tỷ lệ phản ứng nên dùng là chất
1: HNO3 = 1:1,5 [4].
3) Phản ứng ester hóa sử dụng tác nhân SOCl2:
Phản ứng ester hóa sử dụng tác nhân SOCl2 cho hiệu suất rất cao và dễ thực hiện
Hình 3.9: Cơ chế phản ứng ester hóa sử dụng tác nhân SOCl2
Các yếu tố ảnh hưởng:
Tác nhân SOCl2 có thể được dùng dư khoảng 1,5-2 lần để phản ứng xảy ra hoàn toàn. SOCl2 cũng dễ dàng bị loại khỏi sản phẩm sau phản ứng.
Sục khí N2 trước khi thêm tác nhân SOCl2 vào khối phản ứng để đuổi hơi ẩm. Dụng cụ thí nghiệm cũng phải được là khô hoàn toàn. Nguyên liệu, dung môi nên được sấy khô hoặc làm khan nước để hiệu suất phản ứng là tối ưu.
3.5.2. Về thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm
Trong số 6 chất đem thử, chỉ có chất 3b có tác dụng kháng lại chủng Bacillus cereusATCC 9946 (Bc). Điều này có thể giả thích rằng : kết hợp nhóm nitro ở vị trí
số 5 và nhóm ester đã làm tăng hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất 3b so với những hợp chất còn lại, thêm vào đó hợp chất 3b còn ở dạng tự do nên dễ thấm qua màng tế bào vi khuẩn gây tác dụng ức chế.
3.5.3. Về cấu trúc các chất đã tổng hợp
3.5.3.1. Phổ hồng ngoại (IR)
Phân tích phổ hồng ngoại cho phép phân tích được các dải hấp thụ đặc trưng của dao động hóa trị và dao động biến dạng của các nhóm chức và các liên kết điển hình trong cấu trúc phân tử của chất được ghi phổ. Do đó, việc phân tích phổ hồng ngoại chủ yếu xác định nhóm chức để thấy được quá trình phản ứng tạo thành sản phẩm có nhóm chức mong muốn. Ngoài ra, phổ IR được sử dụng để xác định tính đồng nhất của 2 mẫu chất: chất tổng hợp được và chất đã biết.
Trên phổ IR của các chất được trình bày ở 3.3. đều xuất hiện các dao động hóa trị đặc trưng cho các nhóm chức có trong công thức của các chất.
Trên phổ hồng ngoại của sản phẩm 1 xuất hiện các giải hấp thụ đặc trưng của
nhân thơm benzimidazol tại: 3030 cm-1 (cường độ yếu, =C-H thơm), 1629 cm-1 (C=N thơm) và 3421 cm-1 (N-H). Liên kết C-H no của mảnh glutamoyl có đỉnh hấp thụ đặc trưng tại 2907 và 2860 cm-1. Sản phẩm tồn tại ở dạng ion lưỡng cực nên cho giải hấp thụ đặc trưng của nhóm C=O tại số sóng 1574 và 1412 cm-1 với cường độ rất mạnh. Đỉnh hấp thụ tại 1702 cm-1 với cường độ thấp là do một phần sản phẩm có nhóm C=O acid (dimer).
Trên phổ hồng ngoại của sản phẩm 2 xuất hiện các giải hấp thụ đặc trưng của
nhân thơm benzimidazol: 3080 cm-1 (cường độ yếu, =C-H thơm), 3231 cm-1 (N-H). Liên kết C-H no của mảnh glutamoyl có đỉnh hấp thụ đặc trưng tại 2939 và 2860 cm-1. Sản phẩm tồn tại ở dạng ion lưỡng cực nên cho giải hấp thụ đặc trưng của nhóm C=O tại số sóng 1622 cm-1 cường độ rất mạnh. Nhóm nitro xuất hiện với 2 đỉnh đặc trưng tại 1518 và 1348 cm-1. Các vân hấp thụ tại vùng từ 3120 đến 2625 và tại 2010 cm-1 đã chứng tỏ sự tồn tại dạng ion lưỡng cực của sản phẩm
Trên phổ hồng ngoại của sản phẩm 3a xuất hiện các giải hấp thụ đặc trưng của
trưng tại 2933 và 2856 cm-1. Nhóm nitro xuất hiện với 2 đỉnh đặc trưng tại 1514 và 1333 cm-1. Liên kết C=O ester cho đỉnh hấp thụ mạnh tại 1735 cm-1.
Trên phổ hồng ngoại của sản phẩm 3b xuất hiện các giải hấp thụ đặc trưng của
nhân thơm benzimidazol. Liên kết C-H no của mảnh glutamoyl có đỉnh hấp thụ đặc
trưng tại 2920 và 2865 cm-1. Nhóm nitro xuất hiện với 2 đỉnh đặc trưng tại 1521 và
1339 cm-1. Liên kết C=O ester cho đỉnh hấp thụ tại 1730 cm-1 với cường độ yếu và
bị che khuất bởi dải có đỉnh là 1633 cm-1.
Trên phổ hồng ngoại của sản phẩm 4a xuất hiện các giải hấp thụ đặc trưng của nhân thơm benzimidazol: 3050 cm-1 (cường độ yếu, =C-H thơm), 1628 cm-1 (C=N thơm) và 3468 cm-1 (N-H). Liên kết C-H no của mảnh glutamoyl có đỉnh hấp thụ đặc trưng tại 2950 và 2880 cm-1. Đỉnh hấp thụ tại 1746 cm-1 với cường độ mạnh nhất là do nhóm C=O ester của sản phẩm phản ứng. Các vân hấp thụ tại vùng từ 3400 đến 2653 cm-1 đã chứng tỏ có sự tồn tại của dạng muối hydroclorid trong sản phẩm.
Trên phổ hồng ngoại của sản phẩm 4b xuất hiện các giải hấp thụ đặc trưng của
nhân thơm benzimidazol: 3062 cm-1 (cường độ yếu, =C-H thơm), 1628 cm-1 (C=N thơm) và 3489 cm-1 (N-H). Liên kết C-H no của mảnh glutamoyl có đỉnh hấp thụ đặc trưng tại 2950 và 2870 cm-1. Đỉnh hấp thụ tại 1746 cm-1 với cường độ mạnh là do nhóm C=O ester của sản phẩm phản ứng. Các vân hấp thụ tại vùng từ 3400 đến 2870 cm-1 đã chứng tỏ có sự tồn tại của dạng muối hydroclorid trong sản phẩm.
3.5.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR)
Dựa vào phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton để khẳng định chắc chắn cấu trúc của các chất. Phổ 1H-NMR xác định sự có mặt của các nhóm có proton dựa vào độ chuyển dịch hóa học, bộ khung của hợp chất (vòng thơm…), số lượng proton ở C bên cạnh căn cứ vào độ bội của tín hiệu cộng hưởng và sự có mặt của tạp chất (các tín hiệu lạ).
Kết quả phân tích phổ 1H-NMR được trình bày trong mục 3.3,kết quả cho thấy: Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm 1 xuất hiện 4 tín hiệu
7,45 ppm, trong đó tín hiệu của 2 proton tại vị trí số 4 và 7 của nhân này (H-4’ và H-7’) có dạng doublet với hằng số tương tác ortho là 6,0 Hz. Hydro tại carbon bất đối số 2 cho tín hiệu triplet đặc trưng tại 3,44. Các tín hiệu proton còn lại của công thức sản phẩm đều quan sát thấy trên phổ. Tín hiệu do dung môi DMSO xuất hiện ở 2,50 ppm.
Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm 2 xuất hiện 3 tín hiệu
hydro thơm đặc trưng của nhân benzimidazol, trong đó do ảnh hưởng của nhóm nitro hút điện tử mạnh nên các tín hiệu này dịch chuyển mạnh sang trường yếu so với trong nguyên liệu. Các tín hiệu proton còn lại của công thức sản phẩm đều quan sát thấy trên phổ. Tín hiệu do dung môi DMSO xuất hiện ở 2,50 ppm. Tín hiệu của tạp nước trong dung môi xuất hiện tại 3,39 ppm.
Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm 3a xuất hiện tín hiệu của nhóm methyl (ester) với độ chuyển dịch hóa học là 3,89 ppm. 3 tín hiệu hydro thơm đặc trưng của nhân 5-nitro-benzimidazol và các tín hiệu của khung gluamoyl đều quan sát thấy trên phổ. Tín hiệu do dung môi methanol xuất hiện ở 3,37 ppm.
Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm 3b nhóm ethyl (ester)
xuất hiện tại 2 giá trị chuyển dịch hóa học đặc trưng là: 1,18 ppm (-CH3) và 4,08 ppm (-OCH2). Các tín hiệu còn lại của sản phẩm đều quan sát thấy trên phổ.
Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm 4a xuất hiện tín hiệu của nhóm methyl (ester) tại 3,77 ppm dưới dạng singlet. Đáng chú ý là, hydro tại carbon số 2 (H-2) có tín hiệu tại 4,30 ppm (trong khi đó giá trị này của nguyên liệu là 3,44 ppm). Sự dịch chuyển đáng kể sang trường yếu của tín hiệu này khẳng định dạng muối hydroclorid của amin trên carbon số 2. Mặt khác, điều tương tự cũng xảy ra với bộ tín hiệu của nhân thơm benzimidazol: các proton (H-5’, H-6’, H-4’ và H-7’) cho tín hiệu tại vùng 7,40-7,50 ppm - dịch chuyển mạnh sang trường yếu so với nguyên liệu. Nghĩa là có sự tạo muối hydroclorid trên nitơ bậc 3 của nhân benzimidazol, gây hiệu ứng hút điện tử mạnh (NH+). Như vậy, sản phẩm thu được là dạng muối dihydroclorid (S)-methyl 2-amino-4-(1H-benzo[d]imidazol-2- yl)butanoat.
Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm 4b xuất hiện tín hiệu đặc trưng của nhóm ethyl gắn với oxy (ester) tại 1,20 và 4,18 ppm. Đáng chú ý là, hydro tại carbon số 2 (H-2) có tín hiệu tại 4,28 ppm (trong khi đó giá trị này của nguyên liệu là 3,44 ppm). Sự dịch chuyển đáng kể sang trường yếu của tín hiệu này khẳng định dạng muối hydroclorid của amin trên carbon số 2. Mặt khác, điều tương tự cũng xảy ra với bộ tín hiệu của nhân thơm benzimidazol: các proton (H-5’, H-6’, H-4’ và H-7’) cho tín hiệu tại vùng 7,44-7,57 ppm - dịch chuyển mạnh sang trường yếu so với nguyên liệu. Nghĩa là có sự tạo muối hydroclorid trên nitơ bậc 3 của nhân benzimidazol, gây hiệu ứng hút điện tử mạnh (NH+). Như vậy, sản phẩm thu được là dạng muối dihydroclorid (S)-ethyl 2-amino-4-(1H-benzo[d]imidazol-2- yl)butanoat.
3.5.3.3. Phổ khối lượng (MS)
Phổ MS dùng để xác định khối lượng phân tử của các chất tổng hợp đuợc và số khối các mảnh ion bị phân mảnh từ công thức cấu tạo của các chất.
Kết quả phân tích phổ MS trong mục 3.3 đã cho thấy phổ khối lượng của từng chất đều cho các đỉnh cơ bản là các đỉnh có cường độ cao nhất có trị số m/z bằng khối lượng phân tử dự kiến của chất cần phân tích.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Đã tổng hợp được các chất như dự kiến, trong đó các hợp chất 3a, 3b, 4a, 4b
chưa thấy công bố trong các tài liệu tham khảo được. Bao gồm: - Acid 2-amino-4-(1H-benzo[d]imidazol-2-yl)butanoic (1)
- Acid 2-amino-4-(5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)butanoic (2) - Methyl 2-amino-4-(5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)butanoat (3a) - Ethyl 2-amino-4-(5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)butanoat (3b) - Methyl 2-amino-4-(1H-benzo[d]imidazol-2-yl)butanoat (4a) - Ethyl 2-amino-4-(1H-benzo[d]imidazol-2-yl)butanoat (4b)
Dựa trên cơ sở phân tích SKLM, đo nhiệt độ nóng chảy, dữ liệu phân tích phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) chúng tôi đã xác định được cấu trúc của các chất tổng hợp phù hợp với cấu trúc dự kiến.
2. Đã thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của 6 chất: 1, 2, 3a, 3b, 4a, 4b. Chỉ có chất 3b có hoạt tính trên vi khuẩn Bacillus cereus ATCC 9946 (Bc).
Kiến nghị
Để tiếp tục phát triển kết quả của khóa luận này, chúng tôi đưa ra một số đề xuất:
1. Tiếp tục nghiên cứu tổng hợp dẫn chất của 2-amino-4-(1H-benzo[d]imidazol-2- yl)butyric: tạo nhóm thế ở vị trí N1 hoặc thay đổi nhóm alkyl ester.
2. Thử nghiệm các tác dụng sinh học khác của các dẫn chất mới đã tổng hợp (3a,
3b, 4a, 4b) như: tác dụng chống ung thư, giảm đau chống viêm, hạ huyết áp…
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Trần Mạnh Bình (2003), Phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ, Bộ môn
Hóa Hữu Cơ, Trường Đại Học Dược Hà Nội, trang 4-29.
2. Trần Mạnh Bình, Nguyễn Quang Đạt (2007), Hóa học hữu cơ tập II, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, trang 74-92, 232-274.
3. Trần Đức Hậu (2007), Hóa Dược tập 2, Nhà xuất bản y học, Hà Nội, trang 15-18.
4. Nguyễn Đình Luyện (2009), Kỹ thuật hóa dược tập I, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, trang 22-29, 138-144.
Tiếng Anh
5. Anisimova V.A., Spasov A.A. et al. (2006), “Synthesis and biological activity of 9-dialkylaminomethyl-2-oxy (dioxy) phenylimidazo [1,2-a]
