chất:
Hình 2.1: Sơ đồ các giai đoạn tổng hợp acid 2-amino-4-(1H-benzo[d]imidazol-2-
yl)butyric và dẫn chất
Bảng 2.3: Công thức và danh pháp các chất dự kiến tổng hợp
Chất Công thức Danh pháp IUPAC
1 Acid (S)-2-amino-4-(1H-
2 Acid (S)-2-amino-4-(5-nitro-1H- benzo[d]imidazol-2-yl)butanoic 3a (S)-methyl 2-amino-4-(5-nitro-1H- benzo[d]imidazol-2-yl)butanoat 3b (S)-ethyl 2-amino-4-(5-nitro-1H- benzo[d]imidazol-2-yl)butanoat 4a (S)-methyl 2-amino-4-(1H- benzo[d]imidazol-2-yl)butanoat 4b (S)-ethyl 2-amino-4-(1H- benzo[d]imidazol-2-yl)butanoat
2.2.2. Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc của các dẫn chất đã tổng hợp. 2.2.3. Thử hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của một số dẫn chất acid 2-
amino-4-(1H-benzo[d]imidazol-2-yl)butyric tổng hợp được.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Tổng hợp hóa học
- Sử dụng các phương pháp thực nghiệm trong hóa học hữu cơ để tổng hợp các chất dự kiến dựa trên lí thuyết về các phản ứng: ngưng tụ-đóng vòng, phản ứng ester hóa sử dụng tác nhân SOCl2, phản ứng nitro hóa sử dụng tác nhân HNO3/H2SO4.
- Sắc kí lớp mỏng (SKLM) với hệ dung môi thích hợp theo dõi phản ứng và đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm tổng hợp được.
2.3.2.Xác định cấu trúc
Cấu trúc của các chất đã tổng hợp được khẳng định bằng phương pháp phân tích các phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phân tử (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR).
Phổ hồng ngoại (IR):
- Ghi tại Phòng Phân tích cấu trúc phân tử- Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-400cm-1. Mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1: 200 rồi ép dưới dạng viên nén dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm.
Phổ khối lượng phân tử (MS):
- Ghi tại Phòng Phân tích phổ- Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam được ghi trên máy LC/MS/MS-Xevo TQ.
- Ghi tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, máy đo Agilent 6310 Ion Trap.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR):
- Ghi trên máy Brucker AV-500MHz tại Phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.3.Thử tác dụng sinh học
Các chất đã tổng hợp được đánh giá tác dụng sinh học tiến hành trên 5 vi khuẩn Gram(+), 5 vi khuẩn Gram(-) và 2 vi nấm, thực hiện tại bộ môn Vi sinh- Sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội. Các chất tổng hợp được đem thử hoạt tính theo phương pháp khuếch tán trên thạch và sau đó đo kích thước vòng vô khuẩn. Chọn chất đối chiếu là penicillin và streptomycin với kháng khuẩn. Chọn fluconazol là chất đối chiếu với phương pháp kháng nấm.
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Quy trình tổng hợp hóa học
3.1.1. Tổng hợp acid (S)-2-amino-4-(1H-benzo[d]imidazol-2-yl)butanoic
(1)
Sơ đồ phản ứng
Hình 3.1: Sơ đồ tổng hợp chất 1
Chuẩn bị: bình cầu 1 cổ 250mL, sinh hàn hồi lưu, máy khuấy từ gia nhiệt, nhiệt
kế thủy ngân.
Tiến hành: Cho vào bình cầu 5,4g (0,05mol) o-phenylendiamin và 11,1g (0,075mol) acid glutamic, sau đó thêm từ từ 50ml dung dịch HCl 5,5 N. Lắp sinh hàn, đun hồi lưu cách thủy trong 28h.
Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi n-BuOH: AcOH: H2O = 9:2:2,5 tới khi hết vết o-phenylendiamin thì tiến hành xử lý phản ứng thu sản phẩm.
Xử lý: Kết thúc phản ứng, tắt nhiệt, tiếp tục khuấy hỗn hợp phản ứng cho tới khi
nguội. Làm lạnh bên ngoài bình cầu bằng nước đá, nhỏ từ từ dung dịch NaOH 5M vào bình cầu tới pH 8. Hỗn hợp phản ứng được đem chiết với diethyl ether tới khi lớp diethyl ether trong bình chiết trở nên không màu để loại tạp o-phenylendiamin (khoảng 3 lần, mỗi lần 15ml). Điều chỉnh pH của pha nước về khoảng 7 bằng dung dịch HCl 20%, khuấy đều, xuất hiện kết tủa trắng. Khuấy 30 phút. Lọc lấy tủa trên phễu lọc Buchner, rửa tủa bằng ethanol 96% lạnh 3 lần, mỗi lần 15ml. Sấy khô tủa thu được sản phẩm thô.
Tinh chế: Sản phẩm thô được hòa tan trong dung dịch ethanol 70%, đun hồi lưu
cách thủy cho tan hoàn toàn. Tẩy màu bằng than hoạt, lọc nóng thu dịch lọc. Để kết tinh lạnh qua đêm, lọc lấy tinh thể, rửa bằng ethanol 96% lạnh, sấy khô thu được sản phẩm.
Kết quả:
- Thu được 8,8g sản phẩm. Hiệu suất: 80,4% (tính theo sản phẩm 1). - Cảm quan: Tinh thể hình kim, màu trắng.
- Nhiệt độ nóng chảy: 233-3000C [22].
- SKLM: Rf = 0,26 (n-BuOH: AcOH: H2O = 9: 2: 2,5).
3.1.2. Tổng hợp acid (S)-2-amino-4-(5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)
butanoic (2)
Sơ đồ phản ứng:
Hình 3.2: Sơ đồ tổng hợp chất 2
Chuẩn bị: bình cầu 1 cổ 50mL, cốc có mỏ 100ml, máy khuấy từ, pipet 1ml,
pipet 5ml, nước đá, khí trơ N2.
Tác nhân sulfo-nitric: cho vào ống nghiệm 1,5 ml dung dịch acid HNO3 68% (0,0162 mol) và 1,5ml dung dịch acid H2SO4 98% (0,0276 mol).
Tiến hành: Cân 2,19g (0,01 mol) chất 1 cho vào bình cầu 50mL, thêm 8ml
H2SO4 đặc. Khuấy nhẹ nhàng cho tan hết chất 1. Bình cầu được làm lạnh bên ngoài bằng nước đá, sục khí trơ (N2) và đậy nắp bình cầu. Sau khi khuấy và làm lạnh được khoảng 6-8 phút, nhỏ từ từ tác nhân sulfo-nitric đã chuẩn bị ở trên vào trong bình cầu. Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển n-BuOH: AcOH: H2O = 9: 2: 2,5.
Xử lý: Kết thúc phản ứng (khoảng 3h), đổ hỗn hợp phản ứng vào cốc có mỏ chứa 10ml nước cất đã được làm lạnh, làm lạnh bên ngoài cốc có mỏ bằng nước đá. Khuấy đều và thêm từ từ dung dịch Na2CO3 bão hòa tới pH 4,5-5, xuất hiện kết tủa trắng. Để yên khoảng 30 phút. Lọc lấy tủa trên phễu lọc Buchner, rủa tủa bằng nước cất đã làm lạnh 3 lần, mỗi lần 10ml. Sấy khô tủa dưới ánh đèn hồng ngoại thu được sản phẩm.
Kết quả:
- Thu được 2,35g sản phẩm. Hiệu suất: 89,02% (tính theo sản phẩm 2). - Cảm quan: bột màu trắng ngà.
- Nhiệt độ nóng chảy: t0nc = 217-2190C [24].
- SKLM: Rf= 0,58 ( n-BuOH: AcOH: H2O = 9: 2: 2,5).
3.1.3. Tổng hợp (S)-methyl 2-amino-4-(5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)
butanoat (3a)
Sơ đồ phản ứng
Hình 3.3: Sơ đồ tổng hợp chất 3a
Chuẩn bị: bình cầu 2 cổ 100mL, bình chiết 125ml, cốc có mỏ 100ml, máy
khuấy từ gia nhiệt, nhiệt kế thủy ngân, pipet 5ml, pipet 10ml, nước đá, khí N2.
Tiến hành: Cân 1,32 g (5mmol) chất 2 cho vào bình cầu 2 cổ, thêm 30ml
(0,74mol) CH3OH vào bình cầu, bật khuấy từ để phân tán pha rắn 2 vào pha lỏng
(CH3OH) , sục khí N2. Bình cầu được làm lạnh bên ngoài bằng nước đá. Khi nhiệt độ của hỗn hợp trong bình cầu đạt 0-50C, thêm rất từ từ 0,8ml (0,011mol) SOCl2 vào bình cầu. Lắp sinh hàn, đun hồi lưu cách thủy ở 64-650C trong khoảng 2h. Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi n-BuOH: AcOH: H2O (9: 2: 2,5).
Xử lý: Kết thúc phản ứng, tắt nhiệt, tiếp tục khuấy hỗn hợp cho tới khi nguội.
Thêm 0,2 g than hoạt vào hỗn hợp phản ứng để tẩy màu, đun hồi lưu trong 15 phút. Để nguội. Lọc hỗn hợp phản ứng để loại than. Dịch lọc được đem cô tới kiệt trên máy cất quay chân không. Để loại SOCl2 và HCl, thêm 15ml CH3OH vào bình cầu hòa tan cắn rồi đem cất quay tới kiệt. Làm tương tự 3 lần. Thu được sản phẩm thô sau lần cất cuối cùng.
Tinh chế: Thêm 10ml nước cất vào bình cầu hòa tan cắn, sau đó thêm 15 ml CH2Cl2 vào, lắc nhẹ. Nhỏ từ từ dung dịch NH3 0,5% vào trong bình cầu tới khi pH của pha nước đạt 5-6. Cho hỗn hợp phản ứng vào bình chiết, lắc đều trong 5 phút. Để phân lớp, gạn lấy pha hữu cơ. Chiết với CH2Cl2 3 lần, mỗi lần 10ml. Gộp dịch chiết vào bình nón có nút mài. Làm khan bằng Na2SO4 khan. Dịch chiết đem lọc loại bỏ Na2SO4, cho vào bình cầu khô, đã biết khối lượng đem cô cạn dịch lọc thu được sản phẩm dạng dầu, màu vàng. Cân bình cầu tính khối lượng sản phẩm sau tinh chế
Kết quả:
- Thu được 0,7 g sản phẩm. Hiệu suất: 50,36% (tính theo sản phẩm 3a). - Cảm quan: sản phẩm dạng dầu, màu vàng.
- SKLM: Rf = 0,68 (n-BuOH: AcOH: H2O = 9: 2: 2,5).
- Nhận xét: sản phẩm thu được sau khi chiết tồn tại ở dạng dầu, dễ bị oxy hóa. Bảo quản trong bình cầu, sục khí N2 đậy kín, tránh tiếp xúc với ánh sáng.
3.1.4. Tổng hợp (S)-ethyl 2-amino-4-(5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)
butanoat (3b)
Sơ đồ phản ứng
Hình 3.4: Sơ đồ tổng hợp chất 3b
Chuẩn bị: bình cầu 2 cổ 100mL, bình chiết 125ml, cốc có mỏ 100ml, máy
khuấy từ gia nhiệt, nhiệt kế thủy ngân, pipet 5ml, pipet 10ml, nước đá, khí trơ (N2).
Tiến hành: Cân 1,32g (0,005mol) chất 2 cho vào bình cầu 2 cổ, thêm 30ml
(0,51mol) C2H5OH vào bình cầu, khuấy đều để phân tán pha rắn 2 vào pha lỏng
(C2H5OH), sục khí N2. Làm lạnh bên ngoài bình cầu bằng nước đá. Khi nhiệt độ đạt 0-50C, thêm từ từ 2ml (0,0275mol) SOCl2 vào bình cầu. Lắp sinh hàn, đun hồi lưu
cách thủy ở 76-780C trong khoảng 2h. Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi thích hợp.
Xử lý: Khi kết thúc phản ứng, tắt nhiệt, tiếp tục khuấy hỗn hợp cho tới khi nguội. Thêm 0,2g than hoạt vào hỗn hợp phản ứng để tẩy màu, đun hồi lưu trong 15 phút. Sau đó để nguội, lọc loại than. Dịch lọc đem cô cạn trên máy cất quay chân không. Thêm 15ml C2H5OH vào bình cầu hòa tan cắn, đem cất tới kiệt dung môi để loại HCl. Làm tương tự 3 lần. Thu sản phẩm thô sau lần cất cuối cùng.
Tinh chế: Thêm 10ml nước cất vào bình cầu hòa tan cắn, sau đó thêm 15ml CH2Cl2 vào, lắc nhẹ. Nhỏ từ từ dung dịch NH3 0,5% vào trong bình cầu tới khi pH của pha nước đạt 5-6. Cho hỗn hợp phản ứng vào bình chiết, lắc đều trong 5 phút. Gạn lấy pha hữu cơ. Chiết với CH2Cl2 3 lần, mỗi lần 10ml. Gộp dịch chiết vào bình nón có nút mài. Làm khan bằng Na2SO4 khan. Bình cầu 1 cổ 100ml được sấy khô, cân khối lượng bình cầu. Dịch chiết đem lọc loại bỏ Na2SO4, cho vào bình cầu đem cô cạn dịch lọc thu được sản phẩm dạng dầu, màu vàng. Cân bình cầu.
Kết quả:
- Thu được 0,8g sản phẩm. Hiệu suất 54,80% (tính theo sản phẩm 3b). - Cảm quan: sản phẩm dạng dầu, màu vàng.
- SKLM: Rf = 0,70 (n-BuOH: AcOH: H2O = 9: 2: 2,5)
- Bảo quản trong bình cầu, sục khí N2, đậy kín, tránh tiếp xúc với ánh sáng.
3.1.5. Tổng hợp (S)-methyl 2-amino-4-(1H-benzo[d]imidazol-2-yl)butanoat(4a)
Sơ đồ phản ứng:
Hình 3.5: Sơ đồ tổng hợp chất 4a
Chuẩn bị: bình cầu 1 cổ 100mL, bình cầu 2 cổ 100mL, máy khuấy từ, nhiệt kế
Tiến hành: Cân 1,1g (5mmol) chất 1 cho vào bình cầu 2 cổ, thêm 30ml
(0,74mol) CH3OH vào, khuấy đều, sục khí N2. Làm lạnh bên ngoài bình cầu bằng nước đá. Khi nhiệt độ trong bình đạt 0-50C, nhỏ từ từ 0,8ml (11mmol) SOCl2 vào trong bình cầu. Lắp sinh hàn, đun hồi lưu ở 64-650C trong khoảng 3h. Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển n-BuOH: AcOH: H2O = 9: 2: 2,5.
Xử lý: Kết thúc phản ứng, tắt nhiệt, tiếp tục khuấy cho tới nguội. Đổ hỗn hợp
phản ứng vào bình cầu 1 cổ 100mL khô đã biết khối lượng, cất hết dung môi. Thêm tiếp 15ml CH3OH vào bình cầu, cất kiệt để loại SOCl2 dư và HCl. Làm tương tự 3 lần, mỗi lần dùng 15ml CH3OH. Sấy chân không ở 800C. Thu sản phẩm.
Kết quả:
- Thu được 1,50g sản phẩm. Hiệu suất: 97,98% (tính theo dạng muối dihydroclorid).
- Cảm quan: bột màu trắng, xốp, hút ẩm rất mạnh. - SKLM: Rf = 0,55 (n-BuOH: AcOH: H2O = 9: 2: 2,5). - Bảo quản trong bình cầu, sục khí N2, đậy kín.
3.1.6. Tổng hợp (S)-ethyl 2-amino-4-(1H-benzo[d]imidazol-2-yl)butanoat (4b)
Sơ đồ phản ứng:
Hình 3.6. Sơ đồtổng hợp chất 4b
Chuẩn bị: bình cầu 1 cổ 100mL, bình cầu 2 cổ 100mL, máy khuấy từ gia nhiệt,
nhiệt kế thủy ngân, pipet 10ml, pipet 5ml, nước đá, khí trơ (N2).
Tiến hành: Cân 1,1g (5mmol) chất 1 cho vào bình cầu 2 cổ, thêm 30 ml
(0,51mol) C2H5OH vào, khuấy đều, sục khí N2. Làm lạnh bên ngoài bình cầu bằng nước đá. Khi nhiệt độ trong hỗn hợp phản ứng đạt 0-50C, nhỏ từ từ 0,8ml SOCl2 vào trong bình cầu. Lắp sinh hàn, đun hồi lưu cách thủy ở 76-780Ctrong khoảng 3h.
Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển n-BuOH: AcOH: H2O = 9: 2: 2,5.
Xử lý: Kết thúc phản ứng, tắt nhiệt, tiếp tục khuấy cho tới nguội. Đổ hỗn hợp
phản ứng vào bình cầu 1 cổ đã được sấy khô và cân khối lượng, đem cất hết dung môi. Thêm tiếp 15ml C2H5OH vào bình cầu, cất kiệt. Làm tương tự 3 lần, mỗi lần dùng 15ml C2H5OH. Sau khi cất ở lần cuối cùng, sản phẩm được sấy chân không ở 800C. Thu sản phẩm.
Kết quả:
- Thu được 1,57g sản phẩm. Hiệu suất 98,12% (tính theo dạng muối dihydroclorid).
- Cảm quan: bột màu trắng, xốp, hút ẩm mạnh, khi hút ẩm dễ phân hủy. - SKLM: Rf = 0,61 (n-BuOH: AcOH: H2O = 9: 2: 2,5).
3.2. Kiểm tra độ tinh khiết
Tiến hành kiểm tra độ tinh khiết của các các chất tổng hợp được bằng SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy:
- SKLM được tiến hành trên bản nhôm tráng silicagel GF254 70-230 mesh, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm.
- Dung môi hòa tan: EtOH 96%.
- Hệ dung môi khai triển: n-BuOH: AcOH: H2O = 9: 2: 2,5. - Đo nhiệt độ nóng chảy các chất đã tổng hợp.
Giá trị Rf và t0nc của các chất đã tổng hợp được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Rf và t0nc của 6 chất tổng hợp được
Chất Hệ dung môi khai triển Rf T0
nc(0C)
1 n-BuOH: AcOH: H2O (9: 2: 2,5) 0,26 233-300
2 n-BuOH: AcOH: H2O (9: 2: 2,5) 0,56 217-219
3a n-BuOH: AcOH: H2O (9: 2: 2,5) 0,68
3b n-BuOH: AcOH: H2O (9: 2: 2,5) 0,70
4a n-BuOH: AcOH: H2O (9: 2: 2,5) 0,55
Nhận xét:
- Kết quả SKLM với hệ dung môi n-BuOH: AcOH: H2O (9: 2: 2,5) thu được 1 vết sản phẩm, gọn, rõ dưới ánh sáng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm, không có vết lạ.
- Nhiệt độ nóng chảy của chất 2 dao động ở khoảng hẹp: 20C. Sơ bộ kết luận các chất đã tổng hợp được là tinh khiết.
Tiến hành đo phổ để xác định cấu trúc các chất tổng hợp được.
3.3. Kết quả xác định cấu trúc
Cấu trúc của sản phẩm tổng hợp được khẳng định bởi các phương pháp phân tích các phổ: hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và phổ khối lượng (MS).
3.3.1. Khẳng định cấu trúc của acid (S)-2-amino-4-(1H-benzo[d]imidazol-2-yl)butanoic (chất 1) yl)butanoic (chất 1)
Bảng 3.2 dẫn ra kết quả phân tích phổ hồng ngoại của sản phẩm 1.
Bảng 3.2: Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của sản phẩm acid (S)-2-amino-4-
(1H-benzo[d]imidazol-2-yl)butanoic (KBr) (chất 1) Đỉnh hấp thụ đặc trưng (ῡ, cm-1) Nhóm chức 3421 N-H (nhân benzimidazol), O-H acid 3238-2773 NH3+ (ion lưỡng cực) 3030 =C-H (thơm) 2907, 2860 C-H (no) 1702 C=O (acid) 1629 C=N 1574, 1412 C=O (COO - của ion lưỡng cực) 1266 C-O
Bảng 3.3 dẫn ra kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân của chất 1
Bảng 3.3: Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm acid (S)-2-
amino-4-(1H-benzo[d]imidazol-2-yl)butanoic (1H-NMR, DMSO-d6) (chất 1)
Độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) Dạng proton 2,17-2,27 (2H, m, H-3) -CH2- 2,99-3,05 (2H, m, H-4) -CH2- 3,44 (1H, t, J = 6,5 Hz, H- 2) -CH-N 7,08 (2H, m, H-5’, H-6’) =CH thơm 7,45 (2H, 2 d, J = J’ = 6,0 Hz, H-4’, H-7’) =CH thơm
Trên phổ khối lượng (MS) quan sát thấy pic phân tử là: [M+H]+ (m/z 220,1). Điều này phù hợp với công thức phân tử của sản phẩm dự kiến là C11H13N3O2 (M = 219,24).
3.3.2. Khẳng định cấu trúc của acid (S)-2-amino-4-(5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)butanoic (chất 2) yl)butanoic (chất 2)
Bảng 3.4 dẫn ra kết quả phân tích phổ hồng ngoại của sản phẩm phản ứng nitro hóa 2 - (acid (S)-2-amino-4-(5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)butanoic (chất 2).
Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của sản phẩm acid (S)-2-amino-4-(5-
nitro-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)butanoic (KBr) (2)
Đỉnh hấp thụ đặc trưng (ῡ, cm-1) Nhóm chức 3231 N-H (nhân benzimidazol) 3120-2625, 2010 NH3 + (ion lưỡng cực)
3080 =C-H (thơm) 2939, 2860 C-H (no)
