2.4.2.1. Phương pháp bảo quản giống
Bảo quản nấm ký sinh côn trùng là điều rất quan trọng. Để bảo quản ngắn hạn có thể bảo quản ở nhiệt độ 50C đến - 200C, nếu có thể. Để bảo quản dài hạn, có thể bảo quản trong điều kiện - 200C (môi trường nitơ lỏng). Các giống nấm phải được nhận dạng thích hợp.
Việc duy trì tính độc của các giống trong quá trình bảo quản là vô cùng quan trọng. Nấm có thể bị mất tính độc nếu cấy truyền quá nhiều trên môi trường nhân tạo. Để tránh mất độc tính của nấm, chúng ta có thể sử dụng môi trường nuôi cấy từ hệ thống bảo quản vacxin hoặc chúng ta có thể phân lập lại EPF từ các côn trùng được lây nhiễm nhân tạo.
Cùng với việc bảo quản mẫu nấm được phân lập, việc bảo quản các mẫu thu thập cũng rất quan trọng.
Các bước cụ thể để bảo quản EPF như sau:
Bước 1: EPF được nuôi cấy trên môi trường agar trong slope có ít dinh dưỡng như (PDA, PCA,…); hoặc có thể cấy EPF trên đĩa petri hoặc chai lớn và bảo quản chúng trong tủ lạnh ở nhiệt độ 50C. Tiến hành quan sát thường xuyên từ bên ngoài để loại bỏ những mẫu bị nhiễm vi khuẩn hoặc các loại nấm khác.
Bước 2: Nếu EPF được nuôi trong chai có diện tích bề mặt 30 ml nên để cổ chai hướng xuống dưới và có thể bảo quản chúng ở nhiệt độ 50C trong tủ lạnh trong thời gian vài tháng.
Bước 3: Để bảo quản dài hạn, tiến hành phủ paraffin vô trùng vào đầu cổ chai và siết nhẹ nắp chai. Việc bảo quản như thế này có thể bảo quản được giống EPF trong thời gian từ 1 đến 3 năm.
Chú ý: Mỗi một mẫu phân lập nên nhân nuôi và bảo quản trong khoảng 3 chai hoặc slope.
Bước 4: Nấm được phân lập từ côn trùng bị lây nhiễm có thể được bảo quản trong tủ lạnh trong xác chết khô của côn trùng trong thời gian từ 1 đến 3 năm.
Bước 5: Bảo quản các mẫu nấm ký sinh côn trùng thu thập trên thực địa trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 đến 100C.
Chú ý: Ánh sáng tử ngoại (UV) có thể làm tổn thương đến bộ nhiễm sắc thể của các bào tử vô tính của nấm.
Mỗi loại EPF khác nhau có cách thức bảo quản khác nhau.
Việc bảo quản các bào tử vô tính nên tiến hành trong điều kiện lạnh và khô. - Phương pháp chuẩn bị môi trường thạch nghiêng (slope) để bảo quản mẫu nấm Sử dụng ống nghiệm có thể tích 15 hoặc 30 ml có nắp nhựa hoặc không có nắp nhựa. Đối với ống nghiệm không có nắp nhựa, dùng bông sạch để làm nút.
Bước 1: Hấp tiệt trùng ống nghiệm, nút bông, nắp nhựa ở 1210C trong 20 phút. Chuẩn bị môi trường PDA.
Bước 2: Rót môi trường PDA (khi chưa bị đông đặc) vào các ống nghiệm với mức 5 ml (ống nghiệm 15 ml) và 10 ml (ống nghiệm 30 ml).
Bước 3: Đậy nút bông hoặc nắp nhựa (nắp nhựa không được vặn quá chặt), cho vào nồi hấp tiệt trùng ở 1210C trong 20 phút. (Chú ý để đứng ống nghiệm, tránh làm đổ môi trường ra ngoài).
Bước 4: Sau khi kết thúc chế độ là việc của nồi hấp tiệt trùng (ở nhiệt độ 700C), lấy các ống nghiệm ra ngoài để nằm nghiêng khoảng 450.
Vặn chặt nắp nhựa, chờ môi trường nguội và đông đặc lại, ta được môi trường thạch nghiêng (slope).
Bước 5: Tiến hành cấy chuyển mẫu nấm vào các slope trong tủ hốt vô trùng. Bước 6: Để các slope đã cấy nấm trong các tủ nuôi ở nhiệt độ từ 22 đến 240C, theo dõi 2 - 3 ngày để phát hiện và loại bỏ các slope bị nhiễm vi khuẩn và nấm khác.
Các mẫu đạt yêu cầu chuyển sang bảo quản ở chế độ thích hợp.