Nhân sinh khối nấm ký sinh côn trùng là 1 trong 4 phương pháp tiếp cận công nghệ sinh học hiện đại và phù hợp. Trên thế giới đã và đang nghiên cứu ứng dụng nhân nuôi sinh khối nấm ký sinh côn trùng (Cordyceps) theo 3 hướng chủ yếu:
- Phương pháp lây nhiễm bào tử nấm vào cơ thể côn trùng (vật chủ thay thế) để thu hồi quả thể.
Phương pháp này sử dụng các vật chủ thay thế như: Ấu trùng mọt bột vàng Tenebrrio molitor; sâu non và nhộng sâu khoang Spodoptera litura; nhộng tằm Bombyx mori. Để lây nhiễm bào tử nấm vào cơ thể côn trùng có thể sử dụng phương pháp lây nhiễm bằng ngâm côn trùng trong dung dịch chứa bào tử nấm. Hoặc sử dụng phương pháp tiêm dung dịch bào tử nấm trực tiếp vào cơ thể côn trùng
Phương pháp ngâm vật chủ đã được Harata và cộng sự nghiên cứu năm 1995. Trong nghiên cứu của mình, Harada đã sử dụng nhộng loài M. Brassicae để ngâm vào dung dịch chứa bào tử của nấm C. militaris. Kết quả là 30 ngày sau khi nhộng M. Brassicae chết hệ sợi nấm xuất hiện và khoảng 80 ngày sau khi ngâm các thể quả trưởng thành xuất hiện (Harada và cộng sự, 1995). Trong phương pháp ngâm, các bào tử túi phụ thuộc vào các giai đoạn phát triển của nấm sau khi lây nhiễm như: sự nảy mầm, sự xuyên qua lớp vỏ cuticun và sự sản xuất các bào tử nấm trong khoang máu của côn trùng.
Khác với phương pháp lây nhiễm ngâm vật chủ, phương pháp lây nhiễm tiêm trực tiếp dịch bào tử nấm vào xoang cơ thể côn trùng không trải qua giai đoạn đâm xuyên qua lớp vỏ cuticun. Bằng cách tiêm các bào tử vào trong cơ thể côn trùng, có trên 76% cơ thể vật chủ đã sản xuất thể quả và số thể quả trưởng thành đạt trên 64%. Kết quả đạt được tốt nhất là trong trường hợp nhộng của loài M. brassicae ở nhiệt độ 250C, sau đó là S. litura, B. mori và T. molitor. (Hiroki Sato và Mitsuaki Shimazu, 2002) [33].
- Phương pháp nuôi cấy bề mặt.
Nuôi cấy nấm theo phương pháp bề mặt để sản xuất sinh khối thường dùng môi trường rắn, một số trường hợp có thể dùng môi trường lỏng.
Môi trường rắn thường là các nguyên liệu tự nhiên như cám, đôi khi dùng gạo tấm, ngô, bã bia, bã củ cải đường, khoai tây, lõi ngô… hoặc hỗn hợp những nguyên liệu này. Môi trường lỏng thường là rỉ đường, dịch thủy phân từ thóc mầm, nước bã rượu, nước đậu nành… có pha thêm muối khoáng.
Trong nuôi cấy bề mặt, nấm mọc trên bề mặt môi trường rắn hoặc lỏng. Các môi trường rắn trước khi nuôi cấy nấm cần được làm ẩm. Nấm phát triển sẽ lấy những chất dinh dưỡng trong môi trường và sử dụng oxygen phân tử của không khí để hô hấp (Dẫn theo Nguyễn Hoàng Lộc, 2005) [10].
Trên thế giới phương pháp nuôi cấy bề mặt đượcMina Masuda và cộng sự sử dụng để sản xuất cordycepin từ nấm ký sinh côn trùng Cordyceps militaris. Dưới những điều kiện tối ưu, nồng độ cordycepin cao nhất trong môi trường nuôi cấy đạt 640 mg/l, và khả năng sản xuất cordycepin cao nhất là 32 mg/lít/ngày [50].
- Phương pháp nuôi cấy chìm (Công nghệ lên men).
Năm 2004, Xian - Bing Mao và Jian - Jiang Zhong, đã phát triển phương pháp nuôi cấy chìm C. militaris cho việc sản xuất cordycepin với quy mô thương mại sử dụng sự điều chỉnh 2 giai đoạn hòa tan khí oxy và đã cải thiện rõ rệt hiệu quả sản xuất cordycepin. Môi trường nuôi cấy được sử dụng để nghiên cứu bao gồm 40 g/l Gluczơ; 10 g/l Pepton; 0,5 g/l KH2PO4; 0,5 g/l K2HPO4.3H2O và 0,5 g/l MgSO4.7H2O [58].
Chương II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU