a Một sốđặc điểm sinh học, sinh thái của nấm P. graminicola
Nấm P. graminicola thuộc Chi Pythium, lớp Oomycetes trong Giới Chromista. Nấm sản sinh ra các sợi nấm không có vách ngăn là đặc điểm phân biệt loài nấm này với các chi nấm thực khác. Nấm sinh sản vô tính tạo thành các cấu trúc gọi là bọc bào tử động, nơi hình thành và giải phóng du
động bào tử. Những du động bào tử này di chuyển được và có vai trò quan trọng trong chu kỳ bệnh; đặc biệt là chức năng lan truyền trong đất ướt hoặc trên bề mặt cây trồng. Sự hình thành du động bào tử cũng là một đặc điểm phân biệt Pythium với các chi nấm thực khác.
Hình 4.4. Hình ảnh sợi nấm và bào tử trứng và bào tử hậu của nấm Pythium graminicola
Du động bào tử giúp cho việc lan truyền bệnh nhanh chóng từ cây bị
nhiễm bệnh sang cây khỏe. Các bọc bảo tử động của Pythium được hình thành
ở đỉnh hoặc đoạn giữa các sợi nấm, hình tròn (hình cầu) hoặc hình sợi (giống như sợi nấm phình ra). Một ống tháo được hình thành từ bọc bào tử của Pythium, với một bọc giả có thành rất mỏng hình ở cuối ống tháo. Tế bào chất di chuyển từ bọc bào tử qua ống thào và học giả. Các du động bào tử sâu đó phát triển trong bọc giả và được tung ra khi màng bọc giả bị vỡ. Nấm P. graminicola
đã được phân lập từ rễđã gây triệu chứng thối rễ cho cây con trong quá trình lây bệnh nhân tạo. P. graminicola là loài nấm có thể tồn tại lâu dài trong đất dưới dạng bào tử động; bào tử động nảy mầm, sản sinh ra ống mầm hoặc gián tiếp
thông qua việc sản sinh ra du động bào tử bao vào nang bào tử và sau đó nảy mầm; và xâm nhập vào tế bào và mô cây ký chủ (Hình 4.4).
Trên môi trường CMA (Corn Meal Agar), điều kiện nhiệt độ tối ưu cho nấm phát triển là từ 28-30oC và giảm dần khi nhiệt độ tăng cao và ngừng phát triển khi nhiệt độ đạt 40oC. Nhiệt độ tối thấp cho nấm phát triển là 5oC và tối
đa cho nấm phát triển là 37oC. Ở nhiệt độ 30oC, tỷ lệ mọc của nấm là 37mm/ngày (Hình 4.5). 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 10 20 30 40 50 T ỷ l ệ m ọ c (m m /2 4 h rs ) Nhiệt độ (oC)
Hình 4.5. Mối tương quan giữa điều kiện nhiệt độ và sự phát triển của nấm P. graminicola trên môi trường CMA
Mặc dù nhiều yếu tố môi trường ảnh hưởng đến quá trình nảy mầm và nhiễm bệnh, nhưng nhiệt độ và ẩm độ (đặc biệt là sự kết hợp cả hai yếu tố
này) là những nhân tố quan trọng nhất. Trong điều kiện lạnh và đất bị ướt, thì sự nảy mầm và phát triển của cây con chậm như sự nảy mầm của hạt cao lương bị đình trệ, số rễ sơ cấp bị giảm, là yếu tố quan trọng giúp nấm bệnh xâm nhập và gây hại. Tuy nhiên, P. graminicola trên cây cao lương trưởng thành trong điều kiện đất ẩm và ướt thường có quan hệ chặt chẽ với điều kiện nhiệt độ cao. Quá trình nhiễm bệnh của cây cao lương diễn ra trên tất cả các loại rễ ở tất cả các giai đoạn khác nhau, nhưng quá trình nhiễm bệnh ban đầu
ở giải đoạn cây con là quan trọng nhất khi bộ rễ của cây còn non và dễ bị nấm tấn công; quá trình này có thể diễn ra sớm hơn so với sự phát triển của rễ.
b. Kết quả lây bệnh nhân tạo trên cây con
Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo cho cây cao lương được tiến hành trong chậu vại. Thí nghiệm được tiến hành trên 100 cây cao lương khỏe, cùng giống
đã bị nhiễm bệnh trên đồng ruộng chia thành 2 công thức được lây bệnh bằng nguồn nấm P. graminicola và công thức lây bệnh bằng nước cất, thí nghiệm lặp lại 3 lần. Cây lây bệnh được trồng trong đất cát sạch, được hấp khử trùng. Khi cây con được 10 ngày tuổi, tiến hành lây bệnh bằng dung dịch bào tử nấm
P. graminicola với nồng độ 5×106 bào tử/ml, vào trong khay trồng và đặt trong điều kiện nhà lưới, chăm sóc hàng ngày, và ghi nhận, đếm số lượng cây biểu hiện triệu chứng bệnh sau 5, 10, 15, 20, 25 và 30 ngày. Sau khi lây bệnh nhân tạo, tiến hành theo dõi thời gian xuất hiện triệu chứng bệnh, đánh giá tỷ
lệ cây bị bệnh và tái phân lập vi sinh vật gây bệnh từ vết bệnh thu thập được và so với nguồn vi sinh vật phân lập từ cây bị bệnh trên đồng ruộng. Bệnh xuất hiện sau 5 ngày tiến hành lây bệnh nhân tạo,tỉ lệ bệnh tăng nhanh. Sau 10
đền 20 ngày sau lây bệnh nhân tạo tỉ lệ bệnh tăng nhanh, từ 10 đến 15 ngày tỉ
lệ bệnh tăng 24% tiếp theo là từ giai đoạn 15 đến 20 ngày tỉ lệ bệnh tăng 26%. Sau 30 ngày lây bệnh nhân tạo, tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh lên đến 86% (Bảng 4.5).
Sau khi tiến hành lây bệnh nhân tạo, chúng tôi ghi nhận triệu chứng bệnh thối rễ giống với triệu chứng bệnh thối rễ trên đồng ruộng. Vi sinh vật tái phân lập từ triệu chứng là Pythium graminicola đã dùng trong quá trình lây bệnh nhân tạo (Hình 4.6). Như vậy, Pythium graminicola, là nguyên nhân gây
ra bệnh thối rễ cao lương ngọt tại Thái Nguyên năm 2014.
Bảng 4.5. Kết quả lây bệnh nhân tạo bằng nấm Pythium graminicola cho cao lương ngọt vụ xuân năm 2014 tại Thái Nguyên
Đơn vị: (%)
Thời gian theo dõi Lây bệnh bằng nấm P. graminicola Lây bệnh bằng nước cất Số cây bị bệnh Tỷ lệ (%) Số cây bị bệnh Tỷ lệ (%) Sau 5 ngày 2 4 0 0 Sau 10 ngày 5 10 0 0 Sau 15 ngày 17 34 0 0 Sau 20 ngày 30 60 0 0 Sau 25 ngày 39 78 0 0 Sau 30 ngày 43 86 0 0
Hình 4.6. Kết quả lây bệnh nhân tạo bằng nấm P. Graminicola
4.3.2.2. Fusarium moniliforme
a. Một số đặc điểm sinh học, sinh thái của nấm F. moniliforme phân lập từ
vết bệnh thối rễ cao lương ngọt
Fusarium moniliforme là loài nấm đa thực gây bệnh cho nhiều loại cây trồng khác nhau, gây ảnh hưởng lớn đến năng suất và độc tố của nấm đã gây ra bệnh ung thư thực quản ở người. Nấm tồn tại trong tàn dư cây bị bệnh trên
đồng ruộng; sợi nấm, cành bào tử và bào tử nấm được sản sinh trên cây hoặc bên trong thân cây bị bệnh, tồn tại trong đất trong suốt thời gian gieo trồng, và cây trồng có thể bị nhiễm bệnh bất kỳ lúc nào khi điều kiện môi trường thuận lợi cho sự phát triển của bệnh.
Trên cao lương và ngô, nấm F. moniliforme gây ra một số bệnh như
thối thân, thối rễ, thối lõi, mốc hồng hạt là những bệnh phổ biến trên khắp các vùng trồng cao lương và ngô trên thế giới. Ở nước ta, chỉ mới có những nghiên cứu về nấm F. moniliforme trên ngô và nhiều cây trồng khác, nhưng
Đối chứng (nước cất)
chưa có nghiên cứu nào về loài nấm này trên cây cao lương ngọt. Mới đây, một số nghiên cứu về thành phần bệnh nấm hại hạt giống cao lương tại Gia Lâm-Hà Nội cũng đã ghi nhận được sự có mặt và gây hại của F. moniliforme.
Nấm F. moniliforme thuộc bộ Hypocreales, họ Nectriaceae, chi Fusarium. Bào tử có 2 dạng bao gồm bào tử nhỏ và bào tử lớn. Bào tử nhỏ có hình trứng hoặc hình bầu dục, đơn bào, có khi có 2 tế bào, không màu, kích thước bào tử
nhỏ 2,5-6 × 5-12,5µm. Bào tử lớn hình lưỡi liềm hoặc hình thoi, đầu nhọn hơi cong, có thể có những bào tử thẳng, đa bào, có 3-5 vách ngăn, không màu, kích thước bào tử lớn 4-6,5 × 24-45µm (Hình 4.7).
Hình 4.7. Bào tử nấm F. moniliforme phân lập từ vết bệnh thối rễ cao lương
Thí nghiệm được tiến hành trên 6 loại môi trường đặc khác nhau bao gồm: PDA (Potato Dextrose Agar), OMA (Oat Meal Agar), RBA (Rose Bengal Agar), NA (Nutrient Agar), CDA (Czapex-Dox Agar) và YMA (Yeast Malt Agar). Mẫu nấm sau khi được làm thuần trên môi trường WA (Water Agar), được cấy truyền lên 6 loại môi trường nêu trên với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc là một đĩa môi trường. Điều kiện nhiệt độ ủ là là 25oC trong suốt quá trình nuôi cấy. Nấm phát triển mạnh nhất trên môi trường PDA, tiếp theo là môi trường OMA và môi trường YMA với đường kính tản nấm lần lượt là 74,95±0,35, 74,50±0,19 và 73,80±0,15. PDA và YMA là những môi trường dinh dưỡng tốt nhất cho nấm sản sinh bào tử (Bảng 4.6).
Bảng 4.6. Đặc điểm nuôi cấy của nấm F. moniliforme trên các loại môi trường khác nhau
STT Môi trường
Đường kính tản nấm (mm)
Đặc điểm của tản nấm Sản sinh bào tử Sau 4 ngày Sau 7 ngày
1 PDA 43,50±0,21 74,95±0,35 Dạng bông, dạng không
định hình, màu hồng ++++
2 OMA 43,80±0,34 74,50±0,19 Màu tím violet +++
3 RBA 23,98±0,43 56,20±0,37 Màu trắng, dạng bông +++ 4 NA 42,01±0,28 63,90±0,40 Màu trắng, dạng bông ++ 5 CDA 39,05±0,90 57,01±0,15 Màu trắng, dạng bông +++ 6 YMA 43,01±0,18 73,80±0,15 Màu trắng, dạng bông ++++
Ghi chú: ++: Ít sản sinh bào tử; +++: Sản sinh bào tử trung bình; ++++: Sản sinh nhiều bào tử. Kết quả là giá trị trung bình của các thí nghiệm độc lập ±SD, biểu thị đường kính tản nấm.
Sau 5 ngày nuôi cấy, ở ngưỡng nhiệt độ tối thấp 24oC, đường kính tản nấm đạt 54mm; tỷ lệ mọc bình quân của nấm F. moniliforme là 10,8mm/ngày.
Tương tự, ở ngưỡng nhiệt độ 26, 28 và tối cao 30oC, đường kính tản nấm và tỷ lệ mọc lần lượt là 75, 80 và 90mm; 15, 16 và 18mm/ngày (Bảng 4.7). Như
vậy, có thể sử dụng môi trường PDA và YMA để nuôi cấy và tạo bào tử phục vụ thí nghiệm lây bệnh nhân tạo.
Bảng 4.7. Tỷ lệ mọc của nấm Fusarium moniliforme trên môi trường PDA sau 5 ngày nuôi cấy
STT Nhiệt độ (o C) Đường kính tản nấm (mm) Tỷ lệ mọc (mm/ngày) 1 24 54 10,8 2 26 75 15,0 3 28 80 16,0 4 30 90 18,0
b. Kết quả lây bệnh nhân tạo trên cây cao lương con bằng nấm F. moniliforme
Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo cho cây cao lương được tiến hành trong chậu vại. Thí nghiệm được tiến hành trên 100 cây cao lương khỏe, cùng giống
đã bị nhiễm bệnh trên đồng ruộng. Thí nghiệm gồm 2 công thức được lây bệnh bằng nguồn nấm F. moniliforme; và công thức lây bệnh bằng nước cất,
thí nghiệm lặp lại 3 lần. Cây lây bệnh được trồng trong đất cát sạch, được hấp khử trùng. Khi cây con được 10 ngày tuổi, tiến hành lây bệnh bằng dung dịch bào tử với nồng độ 5×106 bào tử/ml vào trong khay trồng và đặt trong điều kiện nhà lưới, chăm sóc hàng ngày, và ghi nhận, đếm số lượng cây biểu hiện triệu chứng bệnh sau 5, 10, 15, 20, 25 và 30 ngày.
Sau khi lây bệnh nhân tạo, tiến hành theo dõi thời gian xuất hiện triệu chứng bệnh, đánh giá tỷ lệ cây bị bệnh và tái phân lập vi sinh vật gây bệnh từ
vết bệnh thu thập được và so với nguồn vi sinh vật phân lập từ cây bị bệnh trên đồng ruộng. Bệnh xuất hiện sau 5 ngày lây bệnh nhân tạo,tỉ lệ bệnh tăng nhanh, sau 30 ngày lây bệnh nhân tạo số cây bị nhiễm bệnh đạt 62% (Bảng 4.8).
Bảng 4.8. Kết quả lây bệnh nhân tạo bằng nấm Fusarium moniliforme cho cao lương ngọt vụ xuân năm 2014 tại Thái nguyên
Thời gian theo dõi
Lây bệnh bằng F.
moniliforme Lây bệnh bằng nước cất Số cây bị bệnh Tỷ lệ (%) Số cây bị bệnh Tỷ lệ (%) Sau 5 ngày 1 2 0 0 Sau 10 ngày 5 10 0 0 Sau 15 ngày 12 24 0 0 Sau 20 ngày 19 38 0 0 Sau 25 ngày 23 46 0 0 Sau 30 ngày 31 62 0 0
Sau khi tiến hành lây bệnh nhân tạo, chúng tôi ghi nhận triệu chứng bệnh thối rễ giống với triệu chứng bệnh thối rễ trên đồng ruộng. Vi sinh vật tái phân lập từ những dạng triệu chứng này là Fusarium moniliforme đúng với vi sinh vật dùng trong quá trình lây bệnh nhân tạo (Hình 4.8). Như vậy,
Fusarium moniliforme cũng là nguyên nhân gây ra bệnh thối rễ cao lương ngọt tại Thái Nguyên năm 2014.
Đối chứng (nước cất)
Fusarium moniliforme
Hình 4.8. Kết quả lây bệnh nhân tạo bằng nấm Fusarium moniliforme
4.3.2.3 Erwinia sp
a. Một số đặc điểm sinh học, sinh thái của vi khuẩn Erwinia sp. phân lập từ
vết bệnh thối rễ cao lương ngọt tại Thái Nguyên
Erwinia sp. sinh trưởng, phát triển và gây hại trong điều kiện. Vi khuẩn xâm nhập vào cây qua những vết thương tạo nên vết thối ướt với mùi hôi khó chịu. Thời tiết khí hậu nóng và ẩm giúp bệnh phát triển mạnh. Vi khuẩn lây lan dựa vào nước mưa, nước tưới và gây bệnh cho cây khỏe xung quanh. Đặc biệt, bệnh phát triển mạnh trong giai đoạn thường xảy ra trong những ngày mưa dầm, trên chân đất thoát nước kém. Thời tiết ẩm độ cao, nhiệt độ cao rất thích hợp cho sự phát triển của bệnh, vi khuẩn có thể bị chết trong điều kiện
khô và dưới ánh nắng trực tiếp. Vi khuẩn Erwinia sp. xâm nhập qua vết thương cơ giới, vết thương do sâu, bệnh hại khác gây ra. Do đó, cần chú ý trồng cao lương tránh giai đoạn cây con vào mùa mưa; tốt nhất là trồng trên nền đất thoát nước tốt và cần xử lý đất, hạt trước khi gieo trồng.
Vi khuẩn Erwinia sp. thuộc họ Enterobacteriaceae, có gram âm, tế bào hình gậy, hai đầu hơi tròn, không có lông roi, kỵ khí không bắt buộc, phản
ứng catalase âm tính và oxidase dương tính. Trên môi trường TTC, khuẩn lạc có màu vàng nhạt, ở giữa có màu hồng nhạt. Trên môi trường PDA-pepton, khuẩn lạc có hình tròn nhỏ, hơi bong, màu vàng nhạt hay màu kem. Vi khuẩn hình gậy, gram âm (Hình 4.9).
Hình 4.9. Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn Erwinia sp
Vi khuẩn phát triển mạnh trong phạm vi nhiệt độ khá rộng, nhiệt độ thích hợp nhất là 27-320C, và nhiệt độ tới hạn chết là 500C. Theo dõi tốc độ tăng trưởng của vi khuẩn bằng cách nuôi cấy dòng vi khuẩn thuần khiết trong môi trường PDA- peptone lỏng ở 28oC. Tiến hành đọc độ đục tế bào trên máy quang phổ
spectrometer ở bước song 405nm. Vi khuẩn có tốc độ tăng trưởng rất nhanh, pha tiềm tàng chỉ diễn ra trong vòng 4-6 giờđầu, sau 6-8 giờ, vi khuẩn đã bước vào pha tăng trưởng và đạt cực đại ở thời điểm khoảng 13-14 giờ sau khi nuôi cấy trước khi chuyển sang pha cân bằng và giảm dần sau đó (Hình 4.10).
0 0,1 0,1 0,2 0,3 0,7 1 1,5 1,52 1,57 1,59 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 0 5 10 15 20 25 Đ ộ đ ụ c
Thời gian nuôi cấy (giờ)
Hình 4.10. Đồ thị biểu diễn tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn Erwinia sp
b.Kết quả lây bệnh nhân tạo trên cây cao lương con bằng vi khuẩn Erwinia sp.
Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo cho cây cao lương được tiến hành trong chậu vại. Thí nghiệm được tiến hành trên 100 cây cao lương khỏe, cùng giống
đã bị nhiễm bệnh trên đồng ruộng. Thí nghiệm gồm 2 công thức được lây bệnh bằng nguồn vi khuẩn có độc tính cao và (sau khi đã được kiểm tra, đánh giá độc tính trên cây thuốc lá); và công thức lây bệnh bằng nước cất, thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Cây lây bệnh được trồng trong đất cát sạch, được hấp khử trùng. Khi cây con được 10 ngày tuổi, tiến hành lây bệnh bằng dịch vi khuẩn vào trong khay trồng và đặt trong điều kiện nhà lưới, chăm sóc hàng ngày, và ghi nhận,
đếm số lượng cây biểu hiện triệu chứng bệnh sau 5, 10, 15, 20, 25 và 30 ngày. Sau khi lây bệnh nhân tạo, tiến hành theo dõi thời gian xuất hiện triệu chứng bệnh, đánh giá tỷ lệ cây bị bệnh và tái phân lập vi sinh vật gây bệnh từ
vết bệnh thu thập được và so với nguồn vi sinh vật phân lập từ cây bị bệnh trên đồng ruộng. Bệnh xuất hiện sau 5 ngày tiến hành lây bệnh nhân tạo, tỉ lệ
bệnh tăng nhanh trong thời gian từ 10 đến 15 ngày sau lây bệnh nhân tạo, sau 30 ngày lây bệnh nhân tạo thì tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh lên đến 78% (Bảng 4.9; Hình 4.11).
Thời gian nuôi cấy (giờ) Đ
ộ đ