5. Nội dung đề tài
2.1.1. Nguyên liệu lá giang
Lá giang đƣợc thu hái tại các vùng quê, đồi núi xung quanh khu vực thành phố Nha Trang (Diên Khánh, Khánh Vĩnh...).
Nguyên liệu lá giang dạng tƣơi (10 kg) đƣợc làm sạch bằng tay, sau đó phơi khô dƣới ánh nắng mặt trời. Sau đó đƣợc xay thành bột, chia thành các phần nhỏ, rồi đem bảo quản trong các túi PA trong điều kiện hút chân không, ở nhiệt độ phòng đến khi sử dụng (Hình 2.1).
Hình 2.1. Quy trình xử lý và bảo quản nguyên liệu lá giang 2.1.2. Hóa chất và thuốc thử
Acid tricloaxetic (TCA), acid gallic và ethanol đƣợc sản xuất tại Trung Quốc; 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), thuốc thử Folin–Ciocalteu,
Cây lá giang tƣơi
Làm sạch
Phơi khô, tách lá
Xay nhỏ
Potassium ferricyanide (K3(Fe[CN]6), Ferric chloride (FeCl3), Sodium carbonate (Na2CO3) đƣợc mua từ công ty Sigma Ardrich (Hoa Kỳ); acid galic mua từ công ty Wako (Nhật Bản). Tất cả hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt hạng phân tích.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp xác định hàm ẩm (phụ lục 1) 2.2.2. Quy trình tổng quát thu dịch chiết từ lá giang 2.2.2. Quy trình tổng quát thu dịch chiết từ lá giang
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Điều kiện chiết: -Dung môi: 0; 25; 50; 75; 100% ethanol -Thời gian: 10; 30; 50; 70; 90; 120 phút -Nhiệt độ: 40; 50; 60; 70; 80oC -Phƣơng pháp chiết: chiết tĩnh và chiết siêu âm
Đánh giá: -Polyphenol -Năng lực khử
-Khả năng chống oxy hóa Nhiệt độ
phòng
Bảo quản lạnh 4oC
Nguyên liệu lá giang tƣơi
Làm sạch
Phơi khô tự nhiên
Tách lá và thân
Xay bột
Chiết Bảo quản
Quy trình tổng quát thu dịch chiết lá giang đƣợc mô tả ở Hình 2.2. Lá giang khô nguyên liệu đƣợc chiết trong các điều kiện (nồng độ dung môi, nhiệt độ và thời gian chiết) khác nhau. Tiếp theo, hỗn hợp đƣợc lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Sau đó, hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết đƣợc xác định, để tìm ra điều kiện chiết thích hợp.
2.2.3. Thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nồng độ dung môi chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm sự ảnh hƣởng của dung môi chiết đến hàm
Bột lá giang khô (xay bột) Chiết Nồng độ ethanol 0% ethanol Lọc Dịch Chiết - Xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số - Đánh giá khả năng chống oxy hóa:
+ Tổng năng lực khử
+ Khả năng khử gốc tự do DPPH
25% ethanol 50% ethanol 75% ethanol
Chọn nồng độ dung môi chiết thích hợp
Cố định các thông số: + Tỷ NL/DM(w/v): 1/100
+ Thời gian chiết: 30 phút + Nhiệt độ chiết: 60o
C
lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch lá giang
Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của dung môi chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang đƣợc mô tả ở Hình 2.3. Cân chính xác 0.25 g nguyên liệu lá giang khô và cho vào bình nón thủy tinh dung lích 25ml. Lá giang khô nguyên liệu đƣợc chiết bằng dung môi ethanol ở các nồng độ khác nhau bao gồm 0; 25; 50; 75 và 100%. Trong thí nghiệm này, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (NL/DM) (w/v): 1/100, nhiệt độ chiết là 60C và thời gian chiết là 30 phút, đƣợc giữ cố định. Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp đƣợc lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Dịch chiết thu đƣợc sau khi lọc đem bổ sung thêm cùng loại dung môi chiết đến một thể tích chính xác (25ml) rồi tiến hành phân tích hàm lƣợng polyphenol tổng số, tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH.
2.2.4. Thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của thời gian chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang
Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của thời gian chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá
giang
Cân chính xác khoảng 0.25g lá giang khô nguyên liệu cho vào bình nón thủy tinh dung tích 50 ml. Lá giang nguyên liệu đƣợc chiết bằng 70% ethanol ở các thời gian chiết khác nhau là 10; 30; 50; 70; 90 và 120 phút, tại cùng nhiệt độ là 60oC, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (NL/DM) (w/v): 1/100 (Hình 2.5). Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp đƣợc lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Dịch chiết thu đƣợc sau khi lọc đƣợc đem bổ sung thêm dung môi chiết (Ethanol 50%) đến một thể tích chính
Chiết
Thay đổi thời gian chiết
10 phút
Lọc Dịch Chiết
- Xác định hàm lƣợng polyphenol - Phân tích hoạt tính chống oxy hóa:
Năng lực khử
Khả năng khử gốc tự do DPPH 30 phút 60 phút 90phút
Chọn ra đƣợc thời gian chiết thích hợp
120phút Lá giang khô (xay bột)
Cố định các thông số: Tỷ lệ NL/DM (w/v): 1/100 Nhiệt độ chiết 60oC
xác (25ml) rồi tiến hành phân tích hàm lƣợng polyphenol tổng số, tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH.
2.2.5. Thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang
Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang đƣợc mô tả ở hình 2.4. Cân chính xác 0.25g lá giang nguyên liệu cho vào bình nón thủy tinh dung tích ml. Lá giang nguyên liệu đƣợc chiết bằng 50% ethanol ở các nhiệt độ khác nhau bao gồm 40; 50; 60; 70 và 80oC, trong cùng khoảng thời gian là 30 phút, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (NL/DM) (w/v): 1/100. Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp đƣợc lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Dịch chiết thu đƣợc sau khi lọc đƣợc đem bổ sung thêm dung môi chiết (Ethanol 50%) đến một thể tích chính xác (25ml) rồi tiến hành phân tích hàm lƣợng polyphenol tổng số, tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH.
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang
Lá giang nguyên liệu (xay bột)
Chiết
Thay đổi nhiệt độ chiết
40oC
Lọc Dịch Chiết
- Xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số - Đánh giá khả năng chống oxy hóa:
+ Tổng năng lực khử + Khả năng khử gốc tự do DPPH 50oC 60oC 80oC Chọn nhiệt độ chiết thích hợp Cố định các thông số: + Tỷ lệ NL/DM (w/v): 1/100 + Thời gian chiết: 30 phút + Dung môi Ethanol 50%
2.2.6. Thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của số lần chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết lá giang polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết lá giang
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng của số lần chiết đến đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết từ lá giang
Lá giang khô nguyên liệu (0.25g) đƣợc cho vào bình nón thủy tinh và tiến hành chiết ở điều kiện chiết thích hợp đã đƣợc xác định ở các bƣớc trên (nồng độ ethanol: 50%; nhiệt độ chiết: 60oC; thời gian chiết: 90 phút, NL/DM (w/v): 1/100. Kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp đƣợc lọc bằng giấy lọc Whatman No.40 để thu dịch chiết (chiết lần 1). Phần bã thu đƣợc từ chiết lần 1 đƣợc tiếp tục chiết trong điều kiện nhƣ trên. Hỗn hợp chiết lần hai đƣợc lọc qua giấy lọc Whatman No.40 để thu dịch chiết (chiết lần 2). Phần bã thu đƣợc từ lần chiết thứ hai tiếp tục thực hiện lần chiết thứ 3 với các điều kiện nhƣ trên. Sau bƣớc nay, ta thu đƣợc dịch chiết thứ 3 (Hình 2.6). Dịch chiết thu đƣợc từ lần chiết thƣ 1, 2 và 3 đƣợc đem đi tiến hành phân tích hoạt tính hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa.
Lá giang khô (xay bột) Chiết lần 1 Chiết lần 2 Bã chiết lần 1 Bã chiết lần 2 Dịch chiết lần 2 Dịch chiết lần 1 Tỷ lệ NL/DM (v/w): 1/100 Dung môi: 50% ethanol Nhiệt độ chiết: 60o
C Thời gian chiết: 90 phút
Chiết lần 3 Tỷ lệ NL/DM (w/v): 1/100
Dung môi: 50% ethanol Nhiệt độ chiết: 60o
C Thời gian chiết: 90 phút
Dịch chiết lần 3 Tỷ lệ NL/DM (v/w): 1/100
Dung môi: 50% ethanol Nhiệt độ chiết: 60o
C Thời gian chiết: 90 phút
2.2.7. Thí nghiệm ảnh hƣởng của phƣơng pháp chiết bằng sóng siêu âm đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của phƣơng pháp chiết bằng sóng siêu âm đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy
hóa của dịch chiết từ lá giang
Lá giang khô (xay bột)
Chiết bằng hai phƣơng pháp khác nhau Đánh sóng siêu âm Lọc Để ở chế độ thƣờng Dịch chiết - Xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số - Xác định hoạt tính chống oxy hóa: + Tổng Năng lực khử + Khả năng khử gốc tự do DPPH Cố định các thông số: + Tỷ lệ NL/DM (w/v): 1/100 + Nhiệt độ chiết: 50o C + Dung môi: 60% ethanol + Thời gian: 90 phút
Chính xác 0.25 g nguyên liệu bột lá giang khô đƣợc cho vào bình nón thủy tinh dung tích 50 ml. Sau đó, cho 25 mL dung dịch 50% ethanol vào bình chứa mẫu và tiến hành chiết ở nhiệt độ 60oC, trong thời gian 90 phút, NL/DM (w/v): 1/100. bằng hai phƣơng pháp khác nhau (chiết tĩnh và dùng sóng siêu âm). Máy tạo sóng siêu âm đƣợc sử dụng trong thí nghiệm là máy Elma, S300H, Elmasonic, Germany. Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp chiết theo hai phƣơng pháp trên đƣợc lọc bằng giấy lọc Whatman No.40 (Hình 2.7). Dịch chiết thu đƣợc đem tiến hành phân tích hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa.
2.2.8. Thí nghiệm xác định sự thay đổi hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy của dịch chiết lá giang trong quá trình bảo quản năng chống oxy của dịch chiết lá giang trong quá trình bảo quản
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định sự thay đổi hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy của dịch chiết lá giang trong quá trình bảo quản
Hình 2.8 mô tả thí nghiệm để xác định sự thay đổi hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy của dịch chiết lá giang trong quá trình bảo quản. Cân chính xác 0.25g nguyên liệu lá giang khô và cho vào bình nón thủy tinh dung tích 25 ml. Sau đó, lá giang nguyên liệu đƣợc chiết với 50% ethanol trong thời gian 90 phút, ở nhiệt
Lá giang khô (xay bột)
Chiết
Bảo quản dịch chiết trong các điều kiện khác nhau
Lọc Dịch Chiết Cố định các thông số: Tỷ lệ NL/DM (w/v): 1/100 Nhiệt độ chiết 60o C Dung môi Ethanol 50% Thời gian 60 phút
Nhiệt độ lạnh ở 4 C Nhiệt độ phòng
6 ngày
0 ngày 1 ngày 2 ngày 3 ngày
- Xác định hàm lƣợng polyphenol - Phân tích hoạt tính chống oxy hóa:
Tổng năng lực khử
Khả năng khử gốc tự do DPPH
độ 60oC, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (NL/DM) (w/v): 1/100. Hỗn hợp sau khi kết thúc quá trình chiết đƣợc lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Dịch chiết thu đƣợc sau khi lọc đƣợc đem đi bảo quản ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ lạnh (4o
C). Sau 1, 2, 3, 4, 5 và 6 ngày bảo quản, dịch chiết đƣợc đem đi xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa.
2.3. Các phƣơng pháp phân tích 2.3.1. Xác định hàm lƣợng polyphenol 2.3.1. Xác định hàm lƣợng polyphenol
Hàm lƣợng polyphenol đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Singleton và cộng sự (1999) [88]. Chính xác 0,1 ml dịch chiết lá giang đƣợc cho vào ống nghiệm. Sau đó, 0,9 ml nƣớc cất và 1 ml dung dịch thuốc thử Folin–Ciocalteu đƣợc thêm vào. Hỗn hợp đƣợc lắc đều bằng máy Vortex và ủ trong thời gian 20 phút. Sau đó, cho 2,5 ml dung dịch Na2CO3 (7,5%) vào, lắc đều và hỗn hợp tiếp tục đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian là 30 phút. Bƣớc sóng của hỗn hợp sau thời gian ủ đƣợc đo ở 760 nm bằng máy quang phổ (Spectrophotometer, Carry 50). Hàm lƣợng polyphenol tổng số đƣợc xác định bằng mg acid gallic tƣơng đƣơng trên 1g nguyên liệu khô (mg GAE/g nguyên liệu khô). Đƣờng chuẩn acid gallic đƣợc trình bày ở phụ lục 2.
2.3.2. Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH
Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Fu và cộng sự (2002) [50] với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Một lƣợng 0,5 ml dịch chiết đƣợc cho vào ống nghiệm. Sau đó, 1ml dung dịch DPPH (0,1 mM) và 2,5 ml nƣớc cất đƣợc thêm vào. Hỗn hợp đƣợc lắc đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian là 30 phút. Bƣớc sóng của hỗn hợp sau khi ủ đƣợc đo ở 517 nm bằng máy quang phổ (Spectrophotometer, Carry 50).
Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang đƣợc xác định theo công thức sau:
Khả năng khử gốc tự do DPPH =A0−A1
A0 x 100 (1)
Trong đó: A0 là độ hấp thụ quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết. A1 là độ hấp thụ quang học của mẫu chứa dịch chiết.
2.3.3. Tổng năng lực khử
Tổng năng lực khử đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Oyaizu (1986) [77] với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết lá giang. Sau đó, 0,5 ml dung dịch K3[Fe(CN)6] (1%) và 0,5 ml đệm phosphat rồi đem lắc đều. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 50oC trong thời gian 20 phút, sau đó thêm 0,5ml dung dịch TCA (10%) và 2 ml nƣớc cất. Cuối cùng, 0,4 ml dung dịch FeCl3 (0,1%) đƣợc cho vào và lắc đều, rồi đem đi đo ở bƣớc sóng 700 nm bằng máy quang phổ (Spectrophotometer, Carry 50). Độ hấp thụ ở 700 nm đƣợc dùng để đánh giá tổng năng lực khử của dịch chiết.
2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các kết quả thí nghiệm đƣợc xác định từ trung bình cộng của hai lần thí nghiệm độc lập. Đồ thì đƣợc vẽ bằng phần mềm MS Excel 2007. Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) phiên bản 16.0. Giá trị trung bình đƣợc phân tích ANOVA theo phép thử Ducan. Giá trị p < 0,05 chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang. tính chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang.
Dung môi chiết là một trong những nhân tố quan trọng ảnh hƣởng tới quá trình chiết. Thí nghiệm này đã tiến hành xác định ảnh hƣởng của của nồng độ dung môi chiết (ethanol) đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa (Hình 3.1; 3.2 và 3.3).
Hình 3.1 cho thấy nồng độ ethanol ảnh hƣởng mạnh đến hàm lƣợng polyphenol tổng số trong dịch chiết lá giang. Sipgno và cộng sự (2007) [89] chỉ ra rằng hiệu quả chiết các hợp chất polyphenol của hỗn hợp dung môi nƣớc - ethanol cao hơn so với dung môi nƣớc và ethanol đơn lẻ. Kết quả nghiên cứu của đã cho thấy phù hợp với nhận định này. Ở nồng độ 0 và 100% ethanol thì dịch chiết cho hàm lƣợng polyphenol thấp hơn so với nồng độ 50 và 75% ethanol. Khi tăng nồng độ ethanol từ 0 đến 75% thì hàm lƣợng polyphenol tăng lên từ 50,2-80,2 mg GAE/g chất khô. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ ethanol từ 75 lên 100% thì hàm lƣợng polyphenol lại giảm xuống từ 80,2-47.9 mg GAE/g chất khô. Theo kết quả thu đƣợc, trong dải nồng độ nghiên cứu, 50% ethanol cho hiệu quả chiết polyphenol là cao nhất. Dung môi chiết là một thông số quan trọng trong quá trình chiết các hợp chất từ nguyên liệu thực vật và động vật. Từ kết quả của nghiên cứu này cho thấy rằng nồng độ dung môi chiết (ethanol) có ảnh hƣởng lớn đến hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết lá giang. Kết quả này tƣơng tự với nhiều nghiên cứu trƣớc đây trên đối tƣợng rong biển và các loài thực vật trên cạn. Chew và cộng sự (2011) [41] nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ ethanol (0-100%) đến hàm lƣợng polyphenol tổng số của rau má Centella asiatica. Kết quả cho thấy nồng độ ethanol