5. Nội dung đề tài
1.3.2. Phƣơng pháp xác định gián tiếp hoạt tính chống oxyhóa
1.3.2.1. Phƣơng pháp cân khối lƣợng
Trong giai đoạn đầu tiên của quá trình oxy hóa, khối lƣợng dầu tăng liên tục do phản ứng giữa các acid béo và oxy để hình thành nên hydroperoxide. Vì vậy, có thể đánh giá sự oxy hóa dầu bằng cách cân khối lƣợng của nó.[99]
1.3.2.2. Chỉ số peroxide (PV)
Chỉ số peroxide vẫn là một phƣơng pháp đo trực tiếp sự phân hủy dầu do oxy hóa. Mặc dù các hydroperoxide bị phân hủy thành một hỗn hợp các sản phẩm bay hơi và chúng có thể phản ứng với nhau để hình thành nên các endoperoxide, chỉ số PV vẫn là một phƣơng pháp rất hữu ích. Tuy nhiên, phƣơng pháp này cần kết hợp với các phƣơng pháp khác để cung cấp nhiều thông tin hơn cho tiến trình oxy hóa dầu.
Phƣơng pháp truyền thống để xác định chỉ số peroxide là phƣơng pháp chuẩn độ. Khi có mặt KI, hydroperoxide sẽ oxy hóa iodide thành iod tự do. Định phân iod tạo thành bằng thiosulphate để xác định hàm lƣợng hydroperroxide [99].
1.3.2.3. Chỉ số para-anisidine
Para-anisidine sẽ phản ứng với aldehyde để tạo thành một sản phẩm có cự đại hấp thụ ở bƣớc sóng 350nm. Chỉ số p-anisidine đƣợc định nghĩa là một độ hấp thu của dung dịch từ phản ứng của 1g chất béo trong 100ml isooctane với p- anisidine(0,25% trong acid acetic băng). Sản phẩm hình thành bởi phản ứng giữa p- anisidine và andehyde không bão hòa (2-ankenal) hấp thụ mạnh tại bƣớc sóng này nên phản ánh đƣợc sự oxy hóa. Mặc dù phƣơng pháp này không phân biệt các sản phẩm bay hơi hay không bay hơi nhƣng phản ứng giữa andehyde bay hơi không bão
hòa xảy ra nhiều hơn so với andehyde bay hơi bão hòa. Vì vậy, chỉ số p-anisidine đƣợc dùng để đánh giá sự hình thành các sản phẩm bậc 2 [99].
1.3.2.4. Chỉ số acid thiobarbituric (TBA)
Manlonaldehyde có thể hình thành từ các acid béo tự do có ít nhất 3 liên kết đôi. Nồng độ của malonadehyde có thể đƣợc tính toán thông qua phản ứng của nó với acid thiobarbituric. Phản ứng giữa hai chất này cho ra một sản phẩm màu đỏ, có cực đại hấp thụ ở bƣớc sóng 532-535nm. Tuy nhiên, phản ứng này không đặc hiệu. Thiobarbituric có thể phản ứng với các thành phần khác nhƣ 2,4 Alkadienal (2,4- decadienal), protein sản phẩm Maillard [99].
1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá rình chiết 1.4.1. Lựa chon dung môi trích ly 1.4.1. Lựa chon dung môi trích ly
Dung môi trích ly là dung môi hòa tan đƣợc các chất cần trích ly. Các polyphenol là các hợp chất phân cực nên chủ yếu sử dụng các dung môi phân cực nhƣ: Nƣớc, Ethanol, Acetone, Ethyl acetate… Chủ yếu ngƣời ta dùng Ethanol.[1], [22].
1.4.2. Diện tích tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi
Cần tăng diện tích này để làm tăng hiệu quả quá trình chiết. đối với nguyên liệu rắn để làm tăng diện tích này thì có thể nghiền hoặc băm nhỏ nguyên liệu. Mặt khác, nghiền hoặc băm có tác dụng làm vỡ tế bào làm thúc đẩy quá trình tiếp xúc triệt để giữa nguyên liệu và dung môi. Tuy nhiên, kích thƣớc và hình dạng của nguyên liệu làm nhỏ cũng có giới hạn. Vì nếu chúng quá mịn sẽ bị lắng đọng lên lớp nguyên liệu, tắc các ống mao dẫn hoặc bị dòng dung dịch có nhiều cặn và làm phức tạp cho quá trình xử lý tiếp theo [1].
1.4.3. Độ ẩm của nguyên liệu
Độ ẩm của nguyên liệu giảm thì tốc độ trích ly tăng, vì độ ẩm tác dụng với protein và các chất háo nƣớc khác, ngăn cản sự dịch chuyển của dung môi thấm sâu vào trong nguyên liệu sẽ làm chậm quá trình khuếch tán [1].
1.4.4. Nhiệt độ trích ly
Theo công thức tính hệ số khếch tán của Eintein, nhiệt độ tăng thì hệ số khuếch tán tăng, do đó theo định luật Fick, lƣợng chất khuếch tán cũng tăng lên. Hơn nữa, khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm, do đó sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng sẽ gây bất lợi cho quá trình chiết xuất trong một số trƣờng hợp sau:
+ Đối với hợp chất kém bền ở nhiệt độ cao: Nhiệt độ cao sẽ gây phá hủy một số hoạt chất nhƣ Vitamine, glycoside, alkaloid…
+ Đối với tạp: khi nhiệt độ tăng, không chỉ độ tan của chất tăng, mà độ tăng của tạp cũng tăng theo, khi đó dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp. Nhất là đối với một số tạp nhƣ gôm, chất nhầy… khi nhiệt độ tăng sẽ bị trƣơng nở, tinh bột bị hồ hóa, độ nhớt của dịch sẽ tăng, gây khó khăn cho quá trình chiết xuất, tinh chế.
+ Đối với dung môi dễ bay hơi có nhiệt độ tấp: khi tăng nhiệt độ thì dung môi sễ bị hao hụt, khi đó thiết bị phải kín và có bộ phận hồi lƣu dung môi.
Từ những phân tích trên tùy từng trƣờng hợp cụ thể mà chọn lựa nhiệt độ chiết sao cho phù hợp (tùy thuộc vào các yếu tố nhƣ nguyên liệu chiết, dung môi, phƣơng pháp chiết…) [22]
1.4.5. Thời gian trích ly
Khi bắt đầu chiết, các chất có khối lƣợng phân tử nhỏ thƣờng là hoạt chất sẽ đƣợc hòa tan và khuếch tán vào dung môi trƣớc, sau đó mới đến các chất có phân tử lƣợng lớn (thƣờng là tạp chất nhƣ nhựa, keo…). Do đó nếu thời gian chiết ngăn sẽ không chiết hết hoạt chất trong dƣợc liệu; nếu thời gian chiết áu dài thì dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản. Tóm lại, cần lựa chọn thời gian chiết, thành phần dƣợc liệu dung môi, phƣơng pháp chiết… phù hợp [22].
1.4.6. Phƣơng pháp trích ly
Thông thƣờng khuấy trộn hay dung các tác nhân vật lý nhƣ song siêu âm, điện từ sẽ tăng cƣờng quá trình hòa tan của các hợp chất, tăng khả năng khuếch tán, quá trình trích ly hiệu quả cao hơn.
CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất
2.1.1. Nguyên liệu lá giang
Lá giang đƣợc thu hái tại các vùng quê, đồi núi xung quanh khu vực thành phố Nha Trang (Diên Khánh, Khánh Vĩnh...).
Nguyên liệu lá giang dạng tƣơi (10 kg) đƣợc làm sạch bằng tay, sau đó phơi khô dƣới ánh nắng mặt trời. Sau đó đƣợc xay thành bột, chia thành các phần nhỏ, rồi đem bảo quản trong các túi PA trong điều kiện hút chân không, ở nhiệt độ phòng đến khi sử dụng (Hình 2.1).
Hình 2.1. Quy trình xử lý và bảo quản nguyên liệu lá giang 2.1.2. Hóa chất và thuốc thử
Acid tricloaxetic (TCA), acid gallic và ethanol đƣợc sản xuất tại Trung Quốc; 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), thuốc thử Folin–Ciocalteu,
Cây lá giang tƣơi
Làm sạch
Phơi khô, tách lá
Xay nhỏ
Potassium ferricyanide (K3(Fe[CN]6), Ferric chloride (FeCl3), Sodium carbonate (Na2CO3) đƣợc mua từ công ty Sigma Ardrich (Hoa Kỳ); acid galic mua từ công ty Wako (Nhật Bản). Tất cả hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt hạng phân tích.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp xác định hàm ẩm (phụ lục 1) 2.2.2. Quy trình tổng quát thu dịch chiết từ lá giang 2.2.2. Quy trình tổng quát thu dịch chiết từ lá giang
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Điều kiện chiết: -Dung môi: 0; 25; 50; 75; 100% ethanol -Thời gian: 10; 30; 50; 70; 90; 120 phút -Nhiệt độ: 40; 50; 60; 70; 80oC -Phƣơng pháp chiết: chiết tĩnh và chiết siêu âm
Đánh giá: -Polyphenol -Năng lực khử
-Khả năng chống oxy hóa Nhiệt độ
phòng
Bảo quản lạnh 4oC
Nguyên liệu lá giang tƣơi
Làm sạch
Phơi khô tự nhiên
Tách lá và thân
Xay bột
Chiết Bảo quản
Quy trình tổng quát thu dịch chiết lá giang đƣợc mô tả ở Hình 2.2. Lá giang khô nguyên liệu đƣợc chiết trong các điều kiện (nồng độ dung môi, nhiệt độ và thời gian chiết) khác nhau. Tiếp theo, hỗn hợp đƣợc lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Sau đó, hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết đƣợc xác định, để tìm ra điều kiện chiết thích hợp.
2.2.3. Thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nồng độ dung môi chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm sự ảnh hƣởng của dung môi chiết đến hàm
Bột lá giang khô (xay bột) Chiết Nồng độ ethanol 0% ethanol Lọc Dịch Chiết - Xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số - Đánh giá khả năng chống oxy hóa:
+ Tổng năng lực khử
+ Khả năng khử gốc tự do DPPH
25% ethanol 50% ethanol 75% ethanol
Chọn nồng độ dung môi chiết thích hợp
Cố định các thông số: + Tỷ NL/DM(w/v): 1/100
+ Thời gian chiết: 30 phút + Nhiệt độ chiết: 60o
C
lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch lá giang
Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của dung môi chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang đƣợc mô tả ở Hình 2.3. Cân chính xác 0.25 g nguyên liệu lá giang khô và cho vào bình nón thủy tinh dung lích 25ml. Lá giang khô nguyên liệu đƣợc chiết bằng dung môi ethanol ở các nồng độ khác nhau bao gồm 0; 25; 50; 75 và 100%. Trong thí nghiệm này, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (NL/DM) (w/v): 1/100, nhiệt độ chiết là 60C và thời gian chiết là 30 phút, đƣợc giữ cố định. Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp đƣợc lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Dịch chiết thu đƣợc sau khi lọc đem bổ sung thêm cùng loại dung môi chiết đến một thể tích chính xác (25ml) rồi tiến hành phân tích hàm lƣợng polyphenol tổng số, tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH.
2.2.4. Thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của thời gian chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang
Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của thời gian chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá
giang
Cân chính xác khoảng 0.25g lá giang khô nguyên liệu cho vào bình nón thủy tinh dung tích 50 ml. Lá giang nguyên liệu đƣợc chiết bằng 70% ethanol ở các thời gian chiết khác nhau là 10; 30; 50; 70; 90 và 120 phút, tại cùng nhiệt độ là 60oC, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (NL/DM) (w/v): 1/100 (Hình 2.5). Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp đƣợc lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Dịch chiết thu đƣợc sau khi lọc đƣợc đem bổ sung thêm dung môi chiết (Ethanol 50%) đến một thể tích chính
Chiết
Thay đổi thời gian chiết
10 phút
Lọc Dịch Chiết
- Xác định hàm lƣợng polyphenol - Phân tích hoạt tính chống oxy hóa:
Năng lực khử
Khả năng khử gốc tự do DPPH 30 phút 60 phút 90phút
Chọn ra đƣợc thời gian chiết thích hợp
120phút Lá giang khô (xay bột)
Cố định các thông số: Tỷ lệ NL/DM (w/v): 1/100 Nhiệt độ chiết 60oC
xác (25ml) rồi tiến hành phân tích hàm lƣợng polyphenol tổng số, tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH.
2.2.5. Thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang
Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang đƣợc mô tả ở hình 2.4. Cân chính xác 0.25g lá giang nguyên liệu cho vào bình nón thủy tinh dung tích ml. Lá giang nguyên liệu đƣợc chiết bằng 50% ethanol ở các nhiệt độ khác nhau bao gồm 40; 50; 60; 70 và 80oC, trong cùng khoảng thời gian là 30 phút, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (NL/DM) (w/v): 1/100. Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp đƣợc lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Dịch chiết thu đƣợc sau khi lọc đƣợc đem bổ sung thêm dung môi chiết (Ethanol 50%) đến một thể tích chính xác (25ml) rồi tiến hành phân tích hàm lƣợng polyphenol tổng số, tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH.
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang
Lá giang nguyên liệu (xay bột)
Chiết
Thay đổi nhiệt độ chiết
40oC
Lọc Dịch Chiết
- Xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số - Đánh giá khả năng chống oxy hóa:
+ Tổng năng lực khử + Khả năng khử gốc tự do DPPH 50oC 60oC 80oC Chọn nhiệt độ chiết thích hợp Cố định các thông số: + Tỷ lệ NL/DM (w/v): 1/100 + Thời gian chiết: 30 phút + Dung môi Ethanol 50%
2.2.6. Thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của số lần chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết lá giang polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết lá giang
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng của số lần chiết đến đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết từ lá giang
Lá giang khô nguyên liệu (0.25g) đƣợc cho vào bình nón thủy tinh và tiến hành chiết ở điều kiện chiết thích hợp đã đƣợc xác định ở các bƣớc trên (nồng độ ethanol: 50%; nhiệt độ chiết: 60oC; thời gian chiết: 90 phút, NL/DM (w/v): 1/100. Kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp đƣợc lọc bằng giấy lọc Whatman No.40 để thu dịch chiết (chiết lần 1). Phần bã thu đƣợc từ chiết lần 1 đƣợc tiếp tục chiết trong điều kiện nhƣ trên. Hỗn hợp chiết lần hai đƣợc lọc qua giấy lọc Whatman No.40 để thu dịch chiết (chiết lần 2). Phần bã thu đƣợc từ lần chiết thứ hai tiếp tục thực hiện lần chiết thứ 3 với các điều kiện nhƣ trên. Sau bƣớc nay, ta thu đƣợc dịch chiết thứ 3 (Hình 2.6). Dịch chiết thu đƣợc từ lần chiết thƣ 1, 2 và 3 đƣợc đem đi tiến hành phân tích hoạt tính hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa.
Lá giang khô (xay bột) Chiết lần 1 Chiết lần 2 Bã chiết lần 1 Bã chiết lần 2 Dịch chiết lần 2 Dịch chiết lần 1 Tỷ lệ NL/DM (v/w): 1/100 Dung môi: 50% ethanol Nhiệt độ chiết: 60o
C Thời gian chiết: 90 phút
Chiết lần 3 Tỷ lệ NL/DM (w/v): 1/100
Dung môi: 50% ethanol Nhiệt độ chiết: 60o
C Thời gian chiết: 90 phút
Dịch chiết lần 3 Tỷ lệ NL/DM (v/w): 1/100
Dung môi: 50% ethanol Nhiệt độ chiết: 60o
C Thời gian chiết: 90 phút
2.2.7. Thí nghiệm ảnh hƣởng của phƣơng pháp chiết bằng sóng siêu âm đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của phƣơng pháp chiết bằng sóng siêu âm đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy
hóa của dịch chiết từ lá giang
Lá giang khô (xay bột)
Chiết bằng hai phƣơng pháp khác nhau Đánh sóng siêu âm Lọc Để ở chế độ thƣờng Dịch chiết - Xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số - Xác định hoạt tính chống oxy hóa: + Tổng Năng lực khử + Khả năng khử gốc tự do DPPH Cố định các thông số: + Tỷ lệ NL/DM (w/v): 1/100 + Nhiệt độ chiết: 50o C + Dung môi: 60% ethanol + Thời gian: 90 phút
Chính xác 0.25 g nguyên liệu bột lá giang khô đƣợc cho vào bình nón thủy tinh dung tích 50 ml. Sau đó, cho 25 mL dung dịch 50% ethanol vào bình chứa mẫu và tiến hành chiết ở nhiệt độ 60oC, trong thời gian 90 phút, NL/DM (w/v): 1/100. bằng hai phƣơng pháp khác nhau (chiết tĩnh và dùng sóng siêu âm). Máy tạo sóng siêu âm đƣợc sử dụng trong thí nghiệm là máy Elma, S300H, Elmasonic, Germany. Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp chiết theo hai phƣơng pháp trên đƣợc lọc bằng giấy lọc Whatman No.40 (Hình 2.7). Dịch chiết thu đƣợc đem tiến hành phân tích hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa.
2.2.8. Thí nghiệm xác định sự thay đổi hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy của dịch chiết lá giang trong quá trình bảo quản năng chống oxy của dịch chiết lá giang trong quá trình bảo quản
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định sự thay đổi hàm lƣợng polyphenol tổng