5. Nội dung đề tài
1.2.6. Một số chất chống oxyhóa
1.2.6.1. Acid ascorbic (Vitamin C)
Vitamin C hay Acid ascorbic là chất có khả năng vô hoạt các gốc tự do rất tốt do nó có thể chuyển cho các gốc tự do hai nguyên tử hydro của nó và khi đó nó trở thành dehydroasorbic (Pincemail & công sự, 1998 [78]).
Ngoài khả năng vô hoạt trực tiếp các gốc tự do, vitamin C còn có khả năng hoạt động hiệp lực với các chất chống oxy hóa khác trong cơ thể nhƣ vitamine E, carotenoid và flavonoid. Khi có sự tiếp xúc giữa vitamine E và gốc tự do peroxide của acid béo, vitamine E chuyển điện tử của nó cho gốc tự do nhƣng đồng thời nó trở thành gốc tự do tocopheryl (vitamine E ở dạng oxy hóa). Vitamine C tiến hành khử gốc tocopheryl thành vitamine E nguyên dạng, sẵn sàng vô hoạt các gốc tự do peroxide mới. các carotenoid và các flavonoid khi vô hoạt các gốc tự do cũng đƣợc hoàn nguyên với cơ chế tƣơng tự bởi vitamine C. điều này góp phần hạn chế sự tự kích hoạt oxy hóa (pro-oxydante) của các gốc vitaine E và flavonoid (Burke và cộng sự, 2001 [37]; Jovanovic và Simic, 2000 [59]).
Hình 1.3. Cấu trúc của Vitamin C
Vitamin C có hoạt chất chống oxy hóa khi nó làm giảm oxy hóa chất nhƣ hydrogen peroxide. Ngoài ra, nó cũng làm giảm các ion kim loại tạo ra các gốc tự do thông qua các phản ứng Fenton.
2Fe3+ + ascorbate 2Fe2+ + dehydroascorbate 2Fe2+ + 2H2O2 2OH• + 2 OH ‾
Tocopherol (Vitamin E)
Vitamin E tồn tại ở tám dạng trong tự nhiên: bốn dạng tocopherol và bốn dạng tocotrienol. Cả tám dạng này đều chứa một vòng thơm và một chuỗi mạch thẳng 16
carbon. Các hợp chất tocotrienol khác với các tocopherol là có thêm ba nối đôi ở chuỗi mạch C thẳng. Nhóm hydroxyl gắn với vòng thơm quyết định tính chống oxy hóa của vitamin E trong khi mạch C đảm bảo khả năng hòa tan trong chất béo của chúng (Huang và cộng sự, 2002 [56]).
Tính chất hòa tan trong chất béo của vitamine E giúp chúng có khả năng thâm nhập sâu vào các màng sinh học vốn chứa nhiều acid béo không no và ngăn cản chuỗi phản ứng oxy hóa lipit. Các vitamine E sẽ chuyển hydro của nó cho gốc tự do peroxide. Gốc tocopheryl tạo thành đƣợc khử về trạng thái ban đầu nhờ vitamine C (Niki và cộng sự, 1995 [76]; Huang và cộng sự, 2002 [55]; Pincemail, 2006 [78]).
Tocopherol – OH + LOOo Tocopherol- O + LOOH Với LOO: gốc tự do peroxide.
Khả năng chống oxy hóa của vitamine E phụ thuộc vào mức độ cản trở không gian của các nhóm methyl ở vị trí ortho đối với nhóm hydroxyl ở vòng thơm. Nhóm hydroxyl càng bị cản trở ít (trƣờng hợp δ-tocopherol và δ-tocotrienol), khả năng chống oxy hóa càng cao (Huang và cộng sự, 2002[56]).
Các thực phẩm nguồn gốc thực vật giàu vitamin E nhƣ: đậu xanh (4-6mg%), xà lách (3mg%), lạc, lúa mì, ngô hạt, cà rốt… Đặc biệt vitamin E có rất nhiều ở mầm của các loại hạt: giá đỗ xanh, giá đỗ tƣơng, mầm hạt ngô (15-25mg%), mầm lúa mỳ (25mg%)… Vitamin E cũng có trong một số thực phẩm nguồn gốc động vật nhƣ: trứng gà, thịt bò, cá mè…
1.2.6.2. Carotenoid
Carotenoid là các hợp chất màu hữu cơ có trong thực vật và một số sinh vật có khả năng quang hợp. tùy thuộc vào sự có mặt hay không của nhóm hydroxyl ở cấu trúc vòng mà các carotenoid đƣợc chia thành carotene và xanthophylle. Đối với con ngƣời, các carotenoid là các chất chống oxy hóa quan trọng vì nó có mặt trong nhiều loại thực phẩm đồng thời nó có khả năng hoạt động trong môi trƣờng chất béo là nới rất dễ xảy ra sự oxy hóa và gây hậu quả nghiêm trọng (màng tế bào).
Cơ chế hoạt động chống oxy hóa của các carotenoid bao gồm (Sergio và Robert, 1999 [85]; Mortensen và cộng sự, 2001 [73]; Stahl và Sies, 2003 [90]) Vô hoạt hóa đơn
Vô hoạt hóa các gốc tự do Oxi đơn (1
O2) là sản phẩm phụ của quá trình oxy hóa sinh học và là một cấu tử có mặt trong không khí (Jovanovic và Simic, 2000 [58]; Corol và cộng sự,2002 [46]). Dƣới tác dụng của tia cực tím A (UVA, λ = 320 – 400nm), các phân tử ribofavine, flavinmononucleotid (FMN) và flavin adenine dinucleotid (FAD) hấp thụ năng lƣợng và lên trạng thái kích thích. Các chất này chuyển năng lƣợng cho oxy phân tử để trở lại trạng thái bình thƣờng. Oxy khi nhận năng lƣợng của các chất này trở thành oxy đơn (Krinsky, 1998 [62]). Để chuyển một phân tử oxy bình thƣờng thành oxy đơn cần một năng lƣợng 22 kcal. Phân tử oxy đơn không ở dạng nghịch từ nhƣ bình thƣờng mà ở dạng nghịch từ. Chính do vậy chúng rất dễ dàng phản ứng với AND, lipid, các phân tử không no của màng tế bào và gây bệnh (Corol và cộng sự, 2002 [46]).
Trong số tất cả các chất chống oxy hóa tự nhiên, các carotenoid có khả năng vô hoạt oxy đơn mạnh nhất (Krinsky, 1998 [62]) bởi một cơ chế vật lý. Năng lƣợng dƣ của oxy đơn đƣợc chuyển cho carotenoid, oxy trở về trạng thái bình thƣờng của nó khi carotenoid đƣợc chuyển lên trạng thái kích thích. Các carotenoid này sau đó quay trở lại trạng thái bình thƣờng của nó bằng cách phát ra môi trƣờng năng lƣợng dƣ thừa mà nó nhận đƣợc từ oxy đơn. Khả năng vô hoạt oxy đơn của carotenoid phụ thuộc vào số liên kết đôi có trong mạch C của nó. Mỗi phân tử carotenoid có
khả năng vô hoạt 1.000 phân tử oxi đơn trƣớc khi tham gia vào các phản ứng hóa học và bị biến đổi thành các hợp chất khác (Krinsky, 1998 [62]).
1
O2 + Car 3O2 + Car
3Car Car + nhiệt
Ngoài khả năng vô hoạt oxy đơn, các carotenoid còn vô hoạt các gốc tự do bằng cách kết hợp với các gốc này theo một trong các cơ chế sau (Britton, 1995 [35]; Mortensen và cộng sự, 2001 [73]):
1-
Chuyển điện tử : Car + ROO Car+ + ROO- 2- Chuyển hydro : Car + ROO Car + ROOH 3- Cộng hợp : Car + ROO ROOCar
Trong cơ thể, các carotenoid hoạt động hiệp lực với các chất chống oxy hóa khác. Các gốc tocopheryl đƣợc khử thành dạng hoạt động tocopherol nhờ nhận đƣợc hydro từ vitamine C với chất vận chuyển trung gian là carotenoid [76]; [90].
Khác với polyphenol và vitamine C không đƣợc tích lũy trong cơ thể mà bị thải ra ngoài qua con đƣờng nƣớc tiểu, các carotenoid với đặc điểm hòa tan trong chất béo đƣợc tích lũy trong cơ thể, xâm nhập dễ dàng vào các vị trí dễ bị oxy hóa của chúng cao hơn các chất oxy hóa hòa tan trong nƣớc [55].
1.2.6.3. Polyphenol
Polyphenol là hợp chất mà phân tử của chúng chứa nhiều vòng Benzen, trong đó có một, hai hoặc nhiều hơn hai nhóm Hydroxyl. Dựa vào đặc trƣng cấu tạo hóa học, ngƣời ta chia các hợp chất polyphenol thành ba nhóm chính:[12]
Nhóm hợp chất phenol C6 – C1: Acid Galic.
Nhóm hợp chất phenol C6 – C3: Acid Cafeic.
Nhóm hợp chất phenol C6 – C3 – C6: Catechin, Flavonoid.
Các polyphenol có chứa gốc Pyrocatechic hoặc Pyrogalic nên chúng có thể tham gia phản ứng oxy hóa – khử, phản ứng cộng và ngƣng tụ.
Polyphenol đƣợc chú ý đến bởi khả năng oxy hóa của chúng. Chúng có khả năng chuyển electron trong chuỗi hô hấp bình thƣờng định cƣ trong ti thể. Chúng có đƣợc khả năng đó là do chúng có khả năng tạo phức bền với các kim loại nặng, do đó làm mất hoạt tính xúc tác của chúng, đồng thời chúng có khả năng nhận các gốc tự do tức là có khả năng dập tắt các quà trình tạo ra gốc tự do.
Ngoài ra polyphenol còn có khả năng ức chế sự phát triển của vi nấm. nhiều polyphenol có hoạt tính vitamine P, nghĩa là có khả năng làm tăng độ đàn hồi và chuẩn hóa tính thẩm thấu của vi ti huyết quản.
Hiện nay kể cả trong nƣớc và ngoài nƣớc nhiều tài liệu nghiên cứu polyphenol có khả năng chống oxy hóa của chúng nhƣ:
- Nghiên cứu của Anesini và cộng sự (2003) [26] nghiên cứu hàm lƣợng polyphenol và khả năng chống oxy hóa của trà (Camellia sinensis).
- Nghiên cứu của Chakraborty và cộng sự (2013) [39] xác định hàm lƣợng polyphenol và khả năng chống oxy hóa từ rong nâu
- Nghiên cứu của Trƣơng Thị Thƣơng (2011) [23] xác định động thái biến đổi hợp chất polyohenol và khả năng chống oxy hóa của quả sim thu hái tại Hải dƣơng
- Nghiên cứu của Đàm Kim Nhung và cộng sự (1995) [18] nghiên cứu các chất polyphenol ở một số cay họ cúc (Asteraceae).
1.2.6.4. Một số thực vật có tác dụng chống oxy hóa [1]
- Cây chè: Trong trà xanh chứa nhiều EGCG (Epigallocatechin-3-gallate) là một trong bốn loại polyphenol bao gồm epicatechin (EC), epigallocatechin (EGC), epicatechin–3-gallate (ECG), và EGCG (Epigallocatechin-3-gallate).
Trƣớc kia, các nhà nghiên cứu không đánh giá cao EGCG, thậm chí còn cho rằng nó làm giảm vị ngon của trà. Sau này, với sự nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật Bản về vai trò của trà xanh với sức khỏe, ngƣời ta mới khẳng định công dụng của hoạt chất này. Ngày nay, EGCG đƣợc coi là một chất chống oxy hóa cực hữu hiệu, gấp 100 lần so với vitamine C và 25 lần so với vitamine E. ngoài ra EGCG còn ngăn ngừa bệnh ung thƣ. Ngăn ngừa nguy cơ tiểu đƣờng theo nghiên cứu mới nhất của tiến sĩ Zhuo Fu (2010), EGCG hạ thấp lƣợng đƣờng trong máu ở những con chuột ăn thức ăn có bổ sung EGCG. Hơn nữa, nó còn chống lại sự phá hủy tế bào –một loại tế bào đặc biệt làm nhiệm vụ sản xuất insulin.
- Gấc: trong quả gấc chứa nhiều lycopen. Theo tỷ lệ khối lƣợng nó chứa nhiều lycopen gấp 70 lần cà chua. Ngƣời ta cũng phát hiện thấy nó chứa beta-caroten nhiều gấp 10 lần cà rốt hoặc khoai lang.
Ngoài ra, các carotenoit có mặt trong gấc liên kết với các acid béo mạch dài, tạo ra kết quả là nó có tính hoạt tính sinh học cao hơn. Một nghiên cứu gần đây cho thấy gấc chứa các loại protein có thể ngăn cản sự phát triển của các tế bào ung thƣ.
Beta-carotene là một loại chất có khả năng chống oxy hóa rất cao. Nó có tác dụng chống lại sự lão hóa và các bệnh lý ở phổi, tim, mạch máu, thần kinh… do tiến trình oxy hóa gây ra.
- Nho: nho xanh (hay trắng) cũng đều có chứa chất chống oxy hóa. Một nghiên cứu mới đây khi nhìn vào tổng khả năng chống oxy hóa (theo nhƣ cách đo của ORAC) đã tìm thấy mức độ đáng kể của nho xanh và nho; khả năng chống oxy hóa của nho đỏ là 2016 trong khi của nho xanh là 1789. Nho chứa một hợp chất polyphenol phong phú bao gồm các Flanvoratrol dƣợc biết đến nhƣ là chất chống oxy hóa và có đặc tính chống viêm nhiễm.
- A-ti-sô: Cung cấp một lƣợng đáng kể chất chống oxy hóa. Trong đó silymarin là chất chống oxy hóa chính, có khả năng chống bệnh ung thƣ da và giảm cholesterol.
1.3. Các phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa của các dịch trích từ thực vật[70]
1.3.1. Phƣơng pháp xác định trực tiếp hoạt tính chống oxy hóa.
1.3.1.1. Phƣơng pháp TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity): Xác định hoạt tính chống oxy hóa so với khả năng chống oxy hóa của Trolox [99] hoạt tính chống oxy hóa so với khả năng chống oxy hóa của Trolox [99]
Cation ABTS+[2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)(ABTS)] là một gốc tự do bền. đây là một chất phát quang màu xanh, đƣợc đặc trƣng ở độ hấp thụ 372nm. Khi cho chất chống oxy hóa vào dung dịch chứa ABTS+, các chất chống oxy hóa sẽ khử ion này thành ABTS. Đo độ giảm độ hấp thụ của dung dịch ở bƣớc sóng 734nm để xác định hoạt tính của chất chống oxy hóa trong sự so sánh với chất chuẩn Trolox[6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid]. Trong môi trƣờng kali persulfate, gốc ABTS+ có thể bền hai ngày ở nhiệt độ phòng trong tối.
1.3.1.2. Phƣơng pháp DPPH(Scavenging ability towards radicals): Khả năng khử gốc tự do DPPH [80]. gốc tự do DPPH [80].
1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, do màu tía và có độ hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 517nm. Khi có mặt chất chống oxy hóa, nó sẽ bị khử thành 2,2-Diphenyl-1-picryldrazine (DPPH-H), khi bị khử màu sắc của dung dịch mất dần từ màu tím sang màu vàng [39], [88] do độ giảm độ hấp thụ bằng máy quang phổ (Huang và cộng sự, 2005) ở bƣớc sóng 517nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxy hóa [28].
Hình 1.6. Phản ứng giữa DPPH và một số chất chống oxy hóa
Khả năng khử gốc tự do DPPH là một trong những phép phân tích để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trong vitro thƣờng sử dụng nhất trong nghiên cứu, có đến 90% các nghiên cứu về chất chống oxy hóa sử dụng phép phân tích này (Joon- Kwan và Takeyuki, 2009) [10].
1.3.1.3. Phƣơng pháp ORAC(oxygen radical absorbance capacity): xác định khả năng hấp thụ gốc tự do chứa oxy hoạt động[70],[99] năng hấp thụ gốc tự do chứa oxy hoạt động[70],[99]
phƣơng pháp này có mức độ phân hủy do bị oxy hóa của fluorescein khi có sự hiện diện của peroxy. Phản ứng trong điều kiện này đƣợc so sánh với phản ứng trong sự hiện diện của chất chuẩn Trolox (hay vitamine E) và trong hiện diện của mẫu chứa chất chống oxy hóa cần xác định hoạt tính. Khi fluorescein bị oxy hóa, cƣờng độ phát huỳnh quang sẽ giảm đi. Tiến hành đo cƣờng độ phát quang này liên tục trong 35 phút sau khi them chất oxy hóa vào. Khi có mặt chất chống oxy hóa, sự phân giả fluorescein sẽ chậm hơn. Xây dựng đƣờng cong biễu diễn sự phụ thuộc độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian và vùng dƣới đƣờng cong dùng để tính toán. Kêt quả tính toán là mmol Trolox/g mẫu.
Ƣu điểm của phƣơng pháp ORAC là xác định đƣợc có hoặc không có sự trễ pha trong mẫu chứa các chất chống oxy hóa. Đây là một điều rất thuận lợi khi đo các thực phẩm chứa cả những hợp chất chống oxy hóa có tốc độ phản ứng khác nhau nhiều.
Hình 1.7. Đồ thị miêu tả độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian
1.3.1.4. Phƣơng pháp TRAP (total radical-trapping antioxidant potential): khả năng chống oxy hóa bằng cách bẫy các gốc tự do [70]. năng chống oxy hóa bằng cách bẫy các gốc tự do [70].
Phƣơng pháp TRAP sử dụng các gốc tự do đƣợc tạo thành từ 2,2-azobuis(2- amidinopropane) dihydrochlorinde) (AAPH). Khi AAPH vào môi trƣờng plasma, các chất khử sẽ bị oxy hóa. Quá trình oxy hóa này đƣợc đo đạt thông qua hàm lƣợng oxy tiêu thụ bằng một điện cực. khi có mặt chất chống oxy hóa trong môi trƣờng plasma, quá trình oxy hóa sẽ xảy ra chậm hơn. Giá trị TRAP của mẫu thí nghiệm đƣợc tính toán dựa vào độ dài pha lag của mẫu so với độ dai pha lag của mẫu trắng và độ dài pha lag của chất chuẩn là dung dịch Trolox. Kết quả tính toán là mmol trolox/kg mẫu lỏng.
1.3.1.5. Phƣơng pháp FRAP (ferric reducing-antioxidant power): Lực chống oxy hóa bằng phƣơng pháp khử sắt [70], [99]
FRAP đƣợc đánh giá bằng phƣơbg pháp quang phổ theo Benzie và Strain (1993).
Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxy hóa của phƣơng pháp này là dựa trên khả năng của các chất chống oxy hóa trong việc khử phức Fe3+ -TPTZ [2,4,6- tripyridyl-s-triazine (TPTZ)] (màu tía) thành phức Fe2+ -TPTZ (màu xanh) ở pH thấp. Khi đó, độ tăng cƣờng độ màu xanh tỷ lệ với hàm lƣợng chất chống oxy hóa
có trong nguyên liệu. Mức độ tăng cƣờng độ màu này đƣợc đo ở bƣớc sóng 593nm trong sự so sánh với chất chuẩn là dung dịch FeSO4 hay BHT (Butyllated Hydroxy Toluene).
Khi cho phức Fe3+ -TPTZ vào môi trƣờng chứa chất chống oxy hóa, các chất chống oxy hóa sẽ nhƣờng điện tử cho phức này và sinh ra Fe2+
-TPTZ cùng lúc. Đây là một hạn chế của phƣơng pháp FRAP.
1.3.2. Phƣơng pháp xác định gián tiếp hoạt tính chống oxy hóa 1.3.2.1. Phƣơng pháp cân khối lƣợng 1.3.2.1. Phƣơng pháp cân khối lƣợng
Trong giai đoạn đầu tiên của quá trình oxy hóa, khối lƣợng dầu tăng liên tục do phản ứng giữa các acid béo và oxy để hình thành nên hydroperoxide. Vì vậy, có thể đánh giá sự oxy hóa dầu bằng cách cân khối lƣợng của nó.[99]
1.3.2.2. Chỉ số peroxide (PV)
Chỉ số peroxide vẫn là một phƣơng pháp đo trực tiếp sự phân hủy dầu do oxy hóa. Mặc dù các hydroperoxide bị phân hủy thành một hỗn hợp các sản phẩm bay hơi và chúng có thể phản ứng với nhau để hình thành nên các endoperoxide, chỉ số PV vẫn là một phƣơng pháp rất hữu ích. Tuy nhiên, phƣơng pháp này cần kết hợp với các phƣơng pháp khác để cung cấp nhiều thông tin hơn cho tiến trình oxy hóa dầu.
Phƣơng pháp truyền thống để xác định chỉ số peroxide là phƣơng pháp chuẩn độ. Khi có mặt KI, hydroperoxide sẽ oxy hóa iodide thành iod tự do. Định phân iod tạo thành bằng thiosulphate để xác định hàm lƣợng hydroperroxide [99].
1.3.2.3. Chỉ số para-anisidine
Para-anisidine sẽ phản ứng với aldehyde để tạo thành một sản phẩm có cự đại hấp thụ ở bƣớc sóng 350nm. Chỉ số p-anisidine đƣợc định nghĩa là một độ hấp thu của dung dịch từ phản ứng của 1g chất béo trong 100ml isooctane với p- anisidine(0,25% trong acid acetic băng). Sản phẩm hình thành bởi phản ứng giữa p- anisidine và andehyde không bão hòa (2-ankenal) hấp thụ mạnh tại bƣớc sóng này nên phản ánh đƣợc sự oxy hóa. Mặc dù phƣơng pháp này không phân biệt các sản phẩm bay hơi hay không bay hơi nhƣng phản ứng giữa andehyde bay hơi không bão