5. Nội dung đề tài
2.3. Các phƣơng pháp phân tích
2.3.1. Xác định hàm lƣợng polyphenol
Hàm lƣợng polyphenol đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Singleton và cộng sự (1999) [88]. Chính xác 0,1 ml dịch chiết lá giang đƣợc cho vào ống nghiệm. Sau đó, 0,9 ml nƣớc cất và 1 ml dung dịch thuốc thử Folin–Ciocalteu đƣợc thêm vào. Hỗn hợp đƣợc lắc đều bằng máy Vortex và ủ trong thời gian 20 phút. Sau đó, cho 2,5 ml dung dịch Na2CO3 (7,5%) vào, lắc đều và hỗn hợp tiếp tục đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian là 30 phút. Bƣớc sóng của hỗn hợp sau thời gian ủ đƣợc đo ở 760 nm bằng máy quang phổ (Spectrophotometer, Carry 50). Hàm lƣợng polyphenol tổng số đƣợc xác định bằng mg acid gallic tƣơng đƣơng trên 1g nguyên liệu khô (mg GAE/g nguyên liệu khô). Đƣờng chuẩn acid gallic đƣợc trình bày ở phụ lục 2.
2.3.2. Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH
Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Fu và cộng sự (2002) [50] với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Một lƣợng 0,5 ml dịch chiết đƣợc cho vào ống nghiệm. Sau đó, 1ml dung dịch DPPH (0,1 mM) và 2,5 ml nƣớc cất đƣợc thêm vào. Hỗn hợp đƣợc lắc đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian là 30 phút. Bƣớc sóng của hỗn hợp sau khi ủ đƣợc đo ở 517 nm bằng máy quang phổ (Spectrophotometer, Carry 50).
Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang đƣợc xác định theo công thức sau:
Khả năng khử gốc tự do DPPH =A0−A1
A0 x 100 (1)
Trong đó: A0 là độ hấp thụ quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết. A1 là độ hấp thụ quang học của mẫu chứa dịch chiết.
2.3.3. Tổng năng lực khử
Tổng năng lực khử đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Oyaizu (1986) [77] với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết lá giang. Sau đó, 0,5 ml dung dịch K3[Fe(CN)6] (1%) và 0,5 ml đệm phosphat rồi đem lắc đều. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 50oC trong thời gian 20 phút, sau đó thêm 0,5ml dung dịch TCA (10%) và 2 ml nƣớc cất. Cuối cùng, 0,4 ml dung dịch FeCl3 (0,1%) đƣợc cho vào và lắc đều, rồi đem đi đo ở bƣớc sóng 700 nm bằng máy quang phổ (Spectrophotometer, Carry 50). Độ hấp thụ ở 700 nm đƣợc dùng để đánh giá tổng năng lực khử của dịch chiết.
2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các kết quả thí nghiệm đƣợc xác định từ trung bình cộng của hai lần thí nghiệm độc lập. Đồ thì đƣợc vẽ bằng phần mềm MS Excel 2007. Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) phiên bản 16.0. Giá trị trung bình đƣợc phân tích ANOVA theo phép thử Ducan. Giá trị p < 0,05 chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang. tính chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang.
Dung môi chiết là một trong những nhân tố quan trọng ảnh hƣởng tới quá trình chiết. Thí nghiệm này đã tiến hành xác định ảnh hƣởng của của nồng độ dung môi chiết (ethanol) đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa (Hình 3.1; 3.2 và 3.3).
Hình 3.1 cho thấy nồng độ ethanol ảnh hƣởng mạnh đến hàm lƣợng polyphenol tổng số trong dịch chiết lá giang. Sipgno và cộng sự (2007) [89] chỉ ra rằng hiệu quả chiết các hợp chất polyphenol của hỗn hợp dung môi nƣớc - ethanol cao hơn so với dung môi nƣớc và ethanol đơn lẻ. Kết quả nghiên cứu của đã cho thấy phù hợp với nhận định này. Ở nồng độ 0 và 100% ethanol thì dịch chiết cho hàm lƣợng polyphenol thấp hơn so với nồng độ 50 và 75% ethanol. Khi tăng nồng độ ethanol từ 0 đến 75% thì hàm lƣợng polyphenol tăng lên từ 50,2-80,2 mg GAE/g chất khô. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ ethanol từ 75 lên 100% thì hàm lƣợng polyphenol lại giảm xuống từ 80,2-47.9 mg GAE/g chất khô. Theo kết quả thu đƣợc, trong dải nồng độ nghiên cứu, 50% ethanol cho hiệu quả chiết polyphenol là cao nhất. Dung môi chiết là một thông số quan trọng trong quá trình chiết các hợp chất từ nguyên liệu thực vật và động vật. Từ kết quả của nghiên cứu này cho thấy rằng nồng độ dung môi chiết (ethanol) có ảnh hƣởng lớn đến hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết lá giang. Kết quả này tƣơng tự với nhiều nghiên cứu trƣớc đây trên đối tƣợng rong biển và các loài thực vật trên cạn. Chew và cộng sự (2011) [41] nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ ethanol (0-100%) đến hàm lƣợng polyphenol tổng số của rau má Centella asiatica. Kết quả cho thấy nồng độ ethanol có ảnh hƣởng đáng kể đến hàm lƣợng polyphenol của dịch chiết thu đƣợc. Nồng độ ethanol ở 40% đƣợc xác định là nồng độ cho hàm lƣợng polyphenol tổng số là cao nhất. tƣơng tự thì Nghiên cứu của Baraniak và cộng sự (2002) [29] khi nghiên cứu trên súp lơ đã chọn nồng độ Ethanol là 80%, Emanul và cộng sự (2011) [49] nghiên
cứu trên đối tƣợng trà Atiso (Cynarae folium), đã lựa chon 75% Ethanol là nồng độ tối ƣu để chiết dịch.
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có
nghĩa thống kê p< 0,05)
Từ hình 3.2 nhận thấy tổng năng lực khử của dịch chiết lá giang chịu ảnh hƣởng bởi nồng độ ethanol. Cụ thể, khi tăng nồng độ ethanol từ 0-100% tổng năng lực khử của dịch chiết đƣợc xác định bằng độ hấp thụ tại bƣớc sóng 700 nm, tăng từ 0.53 đến 1.06. Do đó trong dải nồng độ đã nghiên cứu thì ở 100% ethanol là nồng độ tối ƣu nhất. Kết quả này tƣơng tự với nghiên cứu của In Du.H, Seenivasan.R (2013) [57] khi nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ ethanol (20; 60; 80 và 100%) tới tổng năng lực khử của dịch chiết rong biển thì kết quả cho thấy ở nồng độ 100% ethanol là mạnh nhât.
Nhƣ vậy, nồng độ 100% ethanol là nồng độ dung môi cho tổng năng lực khử là cao nhất. Điều này đƣợc giải thích rằng: ngoài hợp chất polyphenol là những chất có khả năng chống oxy hóa thì trong lá giang còn tồn tại một loại chất mà sẽ đƣợc
a b c b a 0 20 40 60 80 100 120 0 25 50 75 100 H à m l ƣ ợn g po ly phe no l t ổng số ( m g G A E/g N L k hô ) Nồng độ ethanol (%)
trích ly tốt trong môi trƣờng 100% ethanol, loại chất này có khả năng cho năng lực khử tốt, do đó mà tại nồng độ dung dịch 50% ethanol cho hàm lƣợng polyphenol tổng số cao nhất, cong ở 100% ethanol lại cho năng lực khử cao nhất.
Hình 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến tổng năng lực khử của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa
thống kê p< 0,05)
Từ hình 3.3 ta có thể thấy nồng độ ethanol cũng ảnh hƣởng tới khả năng khử gốc tự do DPPH theo xu hƣớng tƣơng tự nhƣ hàm lƣợng polyphenol tổng số. Cụ thể, trong khoảng nồng độ ethanol từ 0-50% thì khả năng khử gốc tự do tăng từ 62,98 đến 97,88%. Tại nồng độ ethanol 100% thì khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang chỉ là 96,05%. Kết quả nghiên cứu của Chew và cộng sự (2011) [41] cho thấy khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết rau má tăng lên theo mức độ tăng của nồng độ ethanol từ 0-50%. Khi tiếp tục tăng nồng độ ethanol thì khả năng khử gốc tự do DPPH không tăng. Kết quả này tƣơng tự với kết quả nghiên cứu trong đề tài trên đối tƣợng lá giang. Tƣơng tự, nghiên cứu của Hisamoto và cộng sự (2011) [55] khi nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ ethanol (30; 50; 70 và 100%) tới khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết quả nho, kết quả cho thấy chiết xuất ethanol 50 và 70% cho khả năng khử DPPH cao nhất và nghiên cứu
a b c d e 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 25 50 75 100 Độ hấ p t hụ đ o ở b ƣớc só ng 7 0 0 nm Nồng độ ethanol (%)
gần đây của Samuagam và cộng sự (2013) [82] khi nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến khả năng khử gốc tự do DPPH của một số loại trái cây nhiệt đới, cho thấy 80% ethanol cho khả năng khử lớn nhất đối với chôm chôm (Nepheliumlappaceum), 60% ethanol đối với măng cụt (Garciniamangostana) và 80% ethanol đối với vỏ bòn bon (Lansiumdomesticum).
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có
nghĩa thống kê p< 0,05)
Nhƣ vậy, từ kết quả nghiên cứu có thể kết luận rằng nồng độ ethanol có ảnh hƣởng rất lớn đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang. Điều này có thể đƣợc giải thích nhƣ sau: ethanol phá hủy nguyên sinh chất của tế lá, thấm sâu vào bên trong, làm tăng khả năng khuếch tán chất tan ra môi trƣờng bên ngoài. Nồng độ ethanol thấp sẽ làm giảm khả năng phá hủy tế bào lá giang, do đó diện tích tiếp xúc với dung môi sẽ nhỏ đi, khả năng chiết giảm. Ngoài ra, nồng độ càng thấp thì nƣớc trong dung môi càng nhiều. Nƣớc sẽ thấm vào tế bào làm nó trƣơng nở đồng thời làm chậm quá trình khuếch tán còn chất tan. Do đó lƣợng chất chiết thu đƣợc càng ít. Tuy nhiên, nếu tăng nồng độ lên quá cao sẽ làm các tạp chất cũng tan ra môi trƣờng trích ly do đó sẽ làm giảm hàm lƣợng polyphenol khả
a b c c c 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 25 50 75 100 K hả n ăng khử gố c DP P H ( %) Nồng độ ethanol (%)
năng chống oxy hóa [22], [41], [42]. Nhƣ vậy, để thu đƣợc dịch chiết từ lá giang có hàm lƣợng các chất polyphenol cao và khả năng chống oxy hóa mạnh, thì nồng độ ethanol ở 50% ethanol là dung môi chiết thích hợp.
3.2. Ảnh hƣởng của thời gian chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang. tính chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang.
Thời gian là một thông số ảnh hƣởng lớn đến quá trình chiết. Thông thƣờng hiệu quả chiết các hợp chất trong thực vật tăng lên cùng với thời gian chiết [41]. Trong thí nghiệm này đã tiến hành xác định ảnh hƣởng của của thời gian chiết (10, 30, 60, 90 và 120 phút) đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.7, 3.8 và 3.9.
Hình 3.7 cho thấy thời gian chiết ảnh hƣởng lớn đến hàm lƣợng polyphenol tổng số trong dịch chiết lá giang. Khi chiết trong khoảng thời gian từ 10-50 phút thì hàm lƣợng polyphenol tổng số tăng từ 61,31-93,63 mg GAE/g chất khô. Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng nhiệt độ từ 50-120 phút thì hàm lƣợng polyphenol tổng số tăng chậm 93,63-96,89 mg GAE/g chất khô. Theo nhƣ kết quả phân tích số liệu, 90 phút cho hiệu quả chiết polyphenol là ổn định và phù hợp. Kết quả này tƣơng tự với nghiên cứu của Chew và cộng sự (2011) [41]. Khi nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian (60- 300 phút) chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số của rau má C. asiatica, tác giả xác định đƣợc rằng thời gian có ảnh hƣởng đáng kể đến hàm lƣợng polyphenol của dịch chiết thu đƣợc. 90 phút là khoảng thời gian cho hiệu quả chiết các hợp chất polyphenol là tốt nhất kể cả về hầm lƣợng polyphenol tổng số và năng lƣợng nhiệt. Nhƣ vậy, thời gian có ảnh hƣởng lớn tới hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết lá giang. Điều này có thể đƣợc giải thích nhƣ sau: thời gian đầu các chất có phân tử nhỏ thƣờng là hoạt chất hòa tan và khuếch tán vào môi trƣờng chiết trƣớc, sau đó mới là hỗn hợp polyphenol (thƣờng là các hợp chất cao phân tử) [22]. Do đó, khi thời gian chiết quá ngắn thì chƣa đủ để chiết triệt để các hợp chất polyphenol. Lƣợng chất tan trong nguyên liệu vẫn còn nhiều. Khi thời gian chiết dài, sẽ tăng thời gian khuếch tán cơ chất ra khỏi lá giang, giúp ethanol thẩm thấu vào trong cơ tế
bào lá giang qua các mao quản, khi đó sự hòa tan và khuếch tán chất tan tăng lên [22]. Vì vậy dịch chiết thu đƣợc có hàm lƣợng polyphenol tổng số tăng lên nhanh trong khoảng từ 10 đến 50 phút. Tuy nhiên hàm lƣợng polyphenol trong lá giang có mức giới hạn nhất định, nên nếu tăng thời gian chiết thêm thì cũng không tách thêm đƣợc nhiều nữa. Với thời gian 90 phút, trong điều kiện nhiệt độ và dung môi chiết xác định, hầu hết các hợp chất polyphenol trong lá giang có thể đã đƣợc chiết ra môi trƣờng. Nếu tiếp tục tăng thời gian gian chiết, trong điều kiện nhiệt độ cao (60ᴼC), các hợp chất polyphenol (đặc biệt là các hợp chất không bền ở nhiệt độ cao) sẽ bị phân hủy.
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống kê p< 0,05)
Hình 3.5 mô tả ảnh hƣởng của thời gian chiết đến tổng năng lực khử của dịch chiết lá giang. Tổng năng lực khử của dịch chiết lá giang tăng lên trong khoảng thời gian chiết từ 10 đến 120 phút. Tuy nhiên, tiếp tục tăng thời gian chiết, năng lực khử giảm xuống. Nhƣ đã đề cập ở phần trên, polyphenol có thể là hợp chất chính đóng vai trò vào khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang, tuy nhiên, theo sự tăng lên về thời gian chiết, một lƣợng chất có tính khử trong lá giang đƣợc tách ra, do đó
a b c c cd de 0 20 40 60 80 100 120 10 30 50 70 90 120 H à m l ƣợng po ly ph eno l t ổng s ố (m g G AE /g NL k hô )
tổng năng lực khử đƣợc tăng lên theo thời gian. Từ kết quả nghiên cứu có thể kết luận rằng ở dải thời gian đã khảo sát thì tại 90 phút cho tổng năng lực khử của dịch chiết thích hợp nhất
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của thời gian chiết đến tổng năng lực khử của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống kê
p< 0,05)
Hình 3.6 mô tả thời gian chiết cũng ảnh hƣởng tới khả năng khử gốc tự do DPPH theo xu hƣớng tƣơng tự nhƣ hàm lƣợng polyphenol tổng số. Cụ thể, trong khoảng thời gian từ 10-90 phút thì khả năng khử gốc tự do DPPH tăng từ 47,36- 69,95%. Tuy nhiên, khi ta tăng thời gian từ 90 – 120 phút thì khả năng khử gốc tự do DPPH lại giảm từ 69,95-69,72%. Do đó gian 90 phút trong dải thời gian nghiên cứu là thời gian mà cho khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang là cao nhất. Kết quả này phù hợp với kết quả công bố của Samuagam và cộng sự (2013) [82] khi nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian tới khả năng chống oxy hóa của dịch chiết quả măng cụt. a b c d e f 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 10 30 50 70 90 120 Độ hấ p t hụ đ o ở b ƣớc só ng 7 0 0 nm
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của thời gian chiết đến khả năng khử gốc tự do của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa
thống kê p< 0,05)
Nhƣ vậy, từ kết quả nghiên cứu có thể kết luận rằng nồng độ ethanol có ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang. Điều này đƣợc giải thích nhƣ sau: trong quá trình trích ly, dung môi tác dụng trực tiếp thì còn có yếu tố thời gian. Trong khoảng 90 phút đầu, quá trình khuếch tán vật chất xảy ra nhanh dần và đạt giá trị cực đại tại 90 phút. Sau thời gian này, tốc độ khuếch tán vật chất sẽ tăng chậm hoặc không tăng nữa. Lúc này, nhiệt độ là yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình trích ly. Nếu thời gian kéo dài các chất chống oxi hóa trong dịch chiết phải chịu nhiệt độ càng lâu nên độ bền của nó sẽ giảm xuống. Các thành phần không bền nhiệt sẽ bắt đầu phân hủy sau khi quá trình khuếch tán vật chất đạt đến cân bằng.
3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang. tính chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang.
Giống nhƣ dung môi, thời gian chiết thì nhiệt độ chiết cũng là một trong