3.4.1 Viêm vú lâm sàng
25
Lấy thân nhiệt
Biểu hiện vú viêm: nóng, đỏ, sƣng, đau, cứng Bỏ ăn……
Ta cũng có thể phát hiện bằng mắt thƣơng và cũng có thể dùng CMT để thử
3.4.2 Viêm vú cận lâm sàng (CMT)
Phƣơng pháp thử CMT (California Mastitis Test)
Dùng thuốc thử Leucocytest (có màu tím) thử sữa từ mỗi thùy vú của bò, theo tỉ lệ sữa và thuốc thử là 1:1 (2ml sữa :2ml thuốc thử). Đây là phản ứng bán định lƣợng để đánh giá sự hiện diện của tế bào bạch cầu trong sữa.
Cách tiến hành
Đầu tiên rửa bầu vú, sau đó dùng khăn ấm lau cho sạch bầu vú, vắt bỏ những giọt sữa đầu tiên trên từng thùy vú nhằm tránh tạp khuẩn. Sau đó trên mỗi thùy vú lấy 2ml sữa cho vào 1 trong 4 đĩa trong khai theo thứ tự trƣớc trái (A), trƣớc phải (B), sau trái (C), sau phải (D), sau đó cho thêm 2 ml thuốc thử vào các đĩa trên khay đã vắt 2ml sữa vào đó, lắc nhẹ qua lại vài lần để cho sữa và thuốc thử trộn vào nhau. Sau đó quan sát và đọc kết quả.
26
Bảng 4: Đánh giá kết quả CMT (Lý Thị Liên Khai,1999)
Độ đồng nhất Màu sắc Kết quả Chẩn đoán
Không lợn cợn Màu xám (-) Bình thƣờng
Hơi lợn cợn, độ đặc quánh rất ít, tan
Màu xám hơi ngã tím
(+) Nghi ngờ, có nguy cơ nhiễm
Vón cục, độ đặc quánh ít, không tan
Màu xám tím (++) Viêm vú cận lâm sàng
Đóng vón dày, thành từng đám nhớt
Màu tím (+++) Viêm vú cận lâm sàng
Đóng vón dày giống lòng trắng trứng
Màu tím đậm (++++) Trầm trọng, ranh giới giữa viêm vú cận lâm sàng và lâm sàng
Bảng 5: Giải thích kết quả CMT ( Lý Thị Liên Khai, 1999)
Điểm số Mức độ nhiễm Số lƣợng tế bào/ml sữa
0(-) 1(1+) 2(2+) 3(3+) 4(4+) Không
Có nguy cơ nhiễm với số lƣợng ít Viêm vú cận lâm sàng
Viêm vú cận lâm sàng
Ranh giới giữa viêm vú cận lâm sàng và lâm sàng
100.000 300.000 900.000 2.700.000 8.100.000
27
3.4.3 Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Phƣơng pháp lấy mẫu Phƣơng pháp lấy mẫu
Mẫu sữa: làm vệ sinh bò trƣớc khi lấy mẫu, dùng khăn ấm lau sạch bầu vú. Vắt bỏ vài tia sữa đầu bằng tay sau đó vắt sữa cho vào túi nylon, ghi lại ký hiệu, ngày lấy mẫu. Sau đó sữa đƣợc bảo quản lạnh và đem về phòng thí nghiệm để cấy và phân lập vi khuẩn
3.4.3.1 Vi khuẩn Staphylococcus aureus
Trên môi trƣờng MSA: khuẩn lạc Staphylococcus aureus tròn, màu vàng, rìa gọn, khô, lồi, môi trƣờng chuyển từ màu đỏ sang vàng.
Vi khuẩn đƣợc cấy thuân trên môi trƣờng NA, sau đó tiến hành kiểm tra các phản ứng sinh hóa. Quy trình nuôi cấy và phân lập vi khuẩn đƣợc thể hiện qua sơ đồ.
Bảng 6: Đặc tính sinh hóa đặc trƣng của vi khuẩn Staphylococcus aureus
Vi khuẩn Sinh men catalase Đông huyết tƣơng thỏ Dung huyết
Staphylococcus aureus + + +
Hình 14: Staphylococcus aureus làm đông huyết tƣơng thỏ
Ống 1,2: Đông huyết tƣơng thỏ Ống 3,4: Ống đối chứng
1 2 3 4
Hình 13: Lấy mẫu sữa viêm cho vào túi nylon
28
Sơ đồ 1: Quy trình phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus
(Nguyễn Nhƣ Thanh et al., 1997).
Phản ứng đông huyết tƣơng thỏ ( ) Phản ứng Catalase (+) Phản ứng dung huyết (+) Staphylococcus aureus Kháng sinh đồ 370C 24 giờ 370C 24 giờ 370C 24 giờ
Phân lập trên môi trƣờng MSA
Kiểm tra đặc tính sinh hóa
370C 24 giờ. Khuẩn lạc
S.aureus tròn, màu vàng, rìa gọn, khô
Nhuộm Gram cầu khuẩn Gram ( )
Cho mẫu bệnh phẩm vào môi trƣờng NB
370C 24 giờ.
29
3.4.3.2 Vi khuẩn Streptococcus agalactiae
Trên môi trƣờng BA: khuẩn lạc nghi là Streptococcus agalactiae có hình dạng tròn, nhỏ li ti, giống nhƣ hạt sƣơng và làm tiêu huyết môi trƣờng.
Vi khuẩn đƣợc cấy thuần trên môi trƣờng NA, sau đó tiến hành kiểm tra các phản ứng sinh hóa. Quy trình nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Streptococcus agalactiae đƣợc thực hiện qua sơ đồ.
Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus agalactiae: Phản ứng Catalase (-).
Môi trƣờng NaCl 6,5%, pH = 9,6: Streptococcus agalactiae làm đục môi trƣờng NaCl 6,5%.
Hình 15: Streptococcus làm đục môi trƣờng NaCl 6,5%
Ống 1: Ống đối chứng
Ống 2: Streptococcus làm đục môi trƣờng NaCl 6,5% 1 2
30
Sơ đồ 2: Quy trình phân lập vi khuẩn Streptococcus agalactiae
(Nguyễn Nhƣ Thanh et al., 1997).
Phản ứng Catalase (-) Phát triển trong NaCl 6,5%, pH 9,6
Streptococcus agalactiae
Kháng sinh đồ
370C 24 giờ
370C 24 giờ
Phân lập trên thạch máu BA
Kiểm tra đặc tính sinh hóa
370C 24 giờ. Khuẩn lạc tròn, nhỏ li ti, trong nhƣ hạt sƣơng và làm tiêu huyết môi trƣờng
Nhuộm Gram liên cầu khuẩn Gram ( )
Cho mẫu bệnh phẩm vào môi trƣờng NB
370C 24 giờ.
31
3.4.3.3 Vi khuẩn E.coli
Trên môi trƣờng EMB: khuẩn lạc E.coli to, tròn, hơi lồi, bóng, màu tím ánh kim. Vi khuẩn đƣợc cấy thuần trên môi trƣờng NA, sau đó tiến hành kiểm tra các phản ứng sinh hóa. Quy trình nuôi cấy, phân lập vi khuẩn E.coli đƣợc thực hiện qua sơ đồ.
Bảng 7: Đặc tính sinh hóa đặc trƣng của vi khuẩn E.coli
Vi
khuẩn Lactose/glucose H2S Gas Citrate Di
động VP MR Indol
E.coli +/+ - + - + - + +
32
Sơ đồ 3: Quy trình phân lập vi khuẩn E.coli. (Nguyễn Nhƣ Thanh et al., 1997).
KIA
Escherichia coli
Kháng sinh đồ Phân lập trên môi trƣờng
EMB
Kiểm tra đặc tính sinh hóa
370C 24 giờ. Khuẩn lạc to tròn, hơi lồi bóng, có màu tím ánh kim
Nhuộm Gram trực khuẩn Gram (-)
Cho mẫu bệnh phẩm vào môi trƣờng NB 370C 24 giờ. Mẫu bệnh phẩm (sữa) Indol (+) MR VP(+) Simmons Citrate (-) Glucose (+) Lactose (+) H2S(-)
33
3.4.4 Thực hiện kháng sinh đồ
Kiểm tra tính nhạy của kháng sinh đối với các vi khuẩn nhƣ: Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, E.coli dựa trên nguyên tắc kháng sinh từ đĩa giấy sẽ khuếch tán làm ức chế vi sinh vật kiểm nghiệm, từ đó sẽ tạo nên vòng vô khuẩn quanh đĩa giấy kháng sinh.
Môi trƣờng
Môi trƣờng tiêu chuẩn là môi trƣờng MHA. Bề dày của thạch khoảng 4mm, pH từ 7,2 đến 7,6 ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.
Chuẩn bị canh khuẩn:
Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, E.coli đã qua phản ứng sinh hóa dƣơng tính, đƣợc cấy thuần trên môi trƣờng NA, chuyển khuẩn lạc vào ống có chứa 9ml nƣớc muối sinh lý 9%o sao cho canh khuẩn có độ đục tƣơng đƣơng độ đục ống chuẩn Mc. Farland 0,5 (tƣơng đƣơng 10 8
CFU/ml).
Các đĩa kháng sinh: Cequinome, Ceftiofur, Marbofloxacin, Doxycycline,
Florfenicol, Fosfomycin, Gentamycin, Enrofloxacin, Norfloxacin, Danofloxacin. Phƣơng pháp làm kháng sinh đồ
Dùng Micropipet hút 100 µl canh khuẩn cho vào đĩa thạch, dùng cây tran trang đều vi khuẩn trên mặt thạch MHA tran đến khi mặt thạch khô, dùng kẹp vô trùng lấy các đĩa kháng sinh đặt lên mặt thạch. Khi đặt phải đè nhẹ để đĩa kháng sinh tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch. Khi đặt đĩa kháng sinh ta phải đảm bảo các đĩa không gân nhau dƣới 24mm. kháng sinh khuếch tán ngay sau khi đĩa kháng sinh chạm vào mặt thạch. Vì vậy khi đặt phải chính xác và không dời đổi các đĩa kháng sinh. Ủ đĩa thạch ở 37o
C, sau 16 – 24 giờ sau đó đọc kết quả ( Phạm Hùng Vân, 2002). Đọc kết quả kháng sinh đồ.
Kết quả kháng sinh đƣợc kết luận bằng cách so sánh với bảng đƣờng kính chuẩn ở bảng 7 và 8
34
Bảng 8: Đƣờng kính vòng vô khuẩn chuẩn của một số kháng sinh đối với vi khuần Staphylococcus aureus và Streptococcus agalatiae (NCCLS, 2004; CLSI, 2012) Kháng sinh Kí hiệu Hàm lƣợng kháng sinh/ đĩa (µg) Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) Kháng (≤) Trung bình Nhạy (≥) Ceftiofur Xnl 30 17 18-20 21 Cefquinome C10 10 15 16-21 22 Marbofloxacin Mar 5 14 15-19 20 Doxycycline Do 30 12 13-15 16 Florfenicol Ffc 30 14 15-18 19 Fosfomycin Fos 50 12 13-15 16 Gentamycin Ge 10 12 13-14 15 Enrofloxacin Enr 5 16 17-22 23 Norfloxacin Nr 10 12 13-16 17 Danofloxacin Dn 30 12 13-15 16
Bảng 9: Đƣờng kính vòng vô khuẩn chuẩn của một số kháng sinh đối với vi khuần E.coli (NCCLS, 2004; CLSI, 2012)
Kháng sinh Kí hiệu Hàm lƣợng kháng
sinh/ đĩa (µg) Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm)
Kháng (≤) Trung bình Nhạy (≥) Ceftiofur Xnl 30 17 18-20 21 Cefquinome C10 10 15 16-21 22 Marbofloxacin Mar 5 14 15-19 20 Doxycycline Do 30 10 11-13 14 Florfenicol Ffc 30 14 15-18 19 Fosfomycin Fos 50 12 13-15 16 Gentamycin Ge 10 12 13-14 15 Enrofloxacin Enr 5 16 17-22 23 Norfloxacin Nr 10 12 13-16 17 Danofloxacin Dn 30 10 11-13 14
35
3.4.5 Thử nghiệm điều trị
Bố trí thí nghiệm
Bố trí các con bệnh vào các phác đồ điều trị khác nhau, để xem hiệu quả của phác đồ nào có hiệu quả nhất.
Bảng 10: Bố trí phác đồ điều trị viêm vú Địa điểm Số con điều trị Các phác đồ Phác đồ 1 Phác đồ 2 Phác đồ 3 Phác đồ 4 Trang trại tập trung 49 5 14 30 0 Hộ gia đình 59 20 25 1 13 Tổng cộng 108 25 39 31 13 Chú thích:
- Phác đồ 1: Chỉ vắt sữa nhiều lần (3 giờ vắt 1 lần liên tục 3-5 ngày)
- Phác đồ 2: Thuốc bơm Ceptifi for LC (1 ống 10ml thùy vú ngày trong 3 – 5 ngày)
- Phác đồ 3: Thuốc bơm vú bò (5ml/ vú/ ngày, trong 3 ngày) + Ceptiket, Ketovet, Canci B12 (1ml 25kg thể trọng tiêm trong 3-5 ngày).
- Phác đồ 4: Thuốc bơm Cequin for LC (1 ống thùy vú bơm 3 lần liên tục cách nhau 12 giờ) Cequin 250 (1ml/25kg/ngày tiêm 3-5 ngày)
- Thành phần của thuốc xem trong phần phụ lục
Phƣơng pháp tiến hành điều trị viêm vú.
Bƣớc đầu tiên ta rửa bầu vú sau đó ta dùng khăn nhúng nƣớc ấm lau lại bầu vú cho sạch. Ta vắt vú bị viêm cho hết sữa, dùng thuốc điều trị viêm vú bơm vào núm vú. Khi đƣa thuốc vào ta phải nặn cho ra một ít thuốc để cho đầu thuốc trơn để tránh làm tổn thƣơng long ống núm vú. Khi đƣa vào ta phải đƣa đầu thuốc vào từ từ, bơm thuốc xong ta vuốt thuốc lên bể sữa vào xoa bầu vú cho thuốc thắm cho đều bầu vú. Khi bơm xong ta nhúng núm vú bằng Vime - Iodine 0,5 %.
Khi ta bơm thuốc để điều trị thì ta vắt sữa ra sau đó ta bơm thuốc vào, thời gian bơm của từng loại thuốc khác nhau nen thời gian vắt sữa cũng khác nhau.
36
3.4.6 Các thuốc dùng trong phác đồ a. Kháng sinh a. Kháng sinh
Thuốc bơm vú:
Ceptifi for LC, CEQUIN for LC, thuốc bơm vú Thuốc tiêm: Ceptiket, Cequin 250 b. Thuốc kháng viêm Preso, Ketovet….. c. Thuốc bổ trợ Vime C 1000, Canxi - B12 ……
3.4.7 Chỉ tiêu theo dõi
Hình 17: Bơm thuốc bơm vú Hình 18: Sát trùng núm vú bằng Vime - Iodine
Tỷ lệ bò bị viêm vú lâm sàng = Tổng số bò bệnh Tổng số bò sữa khảo sát x 100 Tỷ lệ bò bị viêm vú cận lâm sàng = Tổng số bò dƣơng tính Tổng số bò sữa thử CMT x 100 Tỷ lệ từng loại vi khuẩn =
Số mẫu phát hiện từng loại vi khuẩn Tổng số mẫu phân lập
37
Các biểu hiện của con vật khi khỏi bệnh
Thân nhiệt cơ thể trở lại bình thƣờng.
Bầu vú hết các biểu hiện viêm, sƣng cứng, kiểm tra sữa bằng CMT sau khi điều trị cho kết quả âm tính.
3.4.8 Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu thu nhập đƣợc bằng phần mềm Excel, minitab 14 và Chi_square_Yates1
Hiệu quả điều trị =
Số bò điều trị khỏi Số bò đƣợc điều trị
x 100 Phác đồ I, II, III,
IV
Tỷ lệ nhạy của từng loại kháng sinh =
Số đĩa nhạy tƣng vi khuẩn Tổng số đĩa cấy khuẩn lạc điển hình
38
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 TỔNG QUÁT VỀ TÌNH HÌNH CHĂN NUÔI BÕ SỮA TẠI CÁC TỈNH 4.1.1 Phƣơng thức chăn nuôi
Quy mô đàn bao gồm:
Trang trại từ 20 con trở lên.
Hộ chăn nuôi trung bình từ 4 - 8 con chuồng
Bò sữa ở trại Quốc Huy tại Long An đều đƣợc nuôi nhốt. Chuồng trại đƣợc xây dựng kiên cố, nền chuồng đƣợc làm bằng xi măng, mái lợp tole cao ráo, có hệ thống thoát nƣớc, có hệ thống xử lý phân (phân đƣợc qua hệ thống bể lắng rồi ra ao cỏ), diện tích nuôi rộng rãi. Chuồng có máng ăn, máng uống riêng, có khu để vắt sữa, có khu nuôi bê tách riêng với bò mẹ. Thức ăn tại trại sử dụng chủ yếu là cỏ voi. Ngoài ra trại còn cho bò ăn thêm hèm bia, cám, rỉ mật đƣờng. Ở trang trại không áp dụng việc tiêm phòng cho bò sữa nên dẫn đến bệnh LMLM cho đàn bò.
Chuồng nuôi bò sữa ở các hộ dân trong hợp tác xã nông nghiệp Evergrowth đƣợc xây dựng bán kiên cố, nền chuồng bằng xi măng, mái lợp tole. Chuồng có máng ăn, máng uống riêng. Diện tích nuôi tƣơng đối nhỏ, không có nơi vắt sữa riêng. Các hộ dân cho bò ăn nhiều loại cỏ nhƣ: cỏ xả, cỏ voi, cỏ molato, cỏ xiteria, cỏ tạp và thức ăn tinh của công ty Proconco. Bò đƣợc tiêm phòng vaccine tụ huyết trùng, LMLM.
4.1.2 Phƣơng thức vắt sữa.
Bò sữa ở trại Quốc Huy tại Long An đƣợc vắt sữa 2 lần mỗi ngày vào buổi sáng và chiều, sau khi vệ sinh và tắm cho bò. Ở trại việc vắt sữa đƣợc sử dụng bằng máy, trƣớc khi vắt sữa bò đƣợc lùa vào chuồng ép tắm rửa sau đó dùng khăn nhúng nƣớc ấm lau sạch bầu vú (mỗi con có một khăn lau riêng), vắt bỏ tia sữa đầu và lắp máy vắt sữa vào bầu vú. Sau khi vắt sữa song thì sát trùng núm vú bằng Vime – Iodine 0,5%.
Các hộ dân trong hợp tác xã nông nghiệp Evergrowth chăn nuôi với số lƣợng bò sữa ít, sữa đƣợc vắt bằng tay. Những hộ chăn nuôi với số lƣợng bò sữa nhiều, sữa đƣợc vắt bằng máy.
Nguồn tiêu thụ sữa chủ yếu là công ty cô gái Hà Lan (Bình Dƣơng).
4.1.3 Tình hình vệ sinh
Chuồng trại đƣợc quét dọn 2 lần ngày vào buổi sáng và buổi chiều trƣớc khi vắt sữa. Ở trang trại định kỳ sát trùng chuồng trại 1 lần tuần. Phân đƣợc gom vào bao, nƣớc thải cho chảy vào bể lắng. Khăn lau đƣợc giặt sạch bằng xà phòng và phơi khô mỗi khi vắt sữa, các dụng cụ lấy sữa cũng đƣợc rữa bằng xà phòng. Những con bị
39
viêm vú không cách ly, tắm rửa bò không sạch làm phân dính từng mảng trên cơ thể bò dễ gây ra bệnh viêm vú.
Những chất thải ở các hộ chăn nuôi đa số không qua xử lý mà cho chảy ra các ao xung quanh chuồng.
4.2 TỈ LỆ BÕ BỊ VIÊM VÖ LÂM SÀNG Bảng 11: Tỉ lệ bò bị viêm vú lâm sàng
Địa điểm Tổng số bò sữa (con) Số bò bị viêm lâm sàng (con) Tỉ lệ (%) Trang trại tập trung 143 15 10,49a Hộ gia đình 142 22 15,49a Tổng 285 37 12,98
a,b: Các giá trị trong cùng một cột mang các số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê, giống nhau thì khác nhau không ý nghĩa thống kê.
- Chúng tôi khảo sát trên 285 con bò ở trang trại và các hộ chăn nuôi thì có 37 con bò bị viêm vú lâm sàng chiếm tỷ lệ 12,98% thấp hơn kết quả của Nguyễn Văn Phát (1999) với tỷ lệ là 26,02% và cao hơn của Nguyễn Minh Trí (2008) với tỷ lệ viêm vú lâm sàng là (11,11%).
- Qua kết quả cho thấy số con bị viêm vú lâm sàng ở hộ gia đình nhiều hơn so với ở trang trại là do việc phát hiện bệnh nhƣng ngƣời dân không chịu điều trị dẫn đến số con bị bệnh viêm vú lâm sàng tăng cao, số con bệnh nặng nhiều đƣa đến loại thải sớm ngày một nhiều dẫn đến thiệt hại kinh tế cho ngƣời chăn nuôi.
- Qua kết quả số con bị viêm vú lâm sàng ở trang trại và hô gia đình thì có sự khác nhau nhƣng qua kết quả thống kê ta thấy sự khác nhau không có ý nghĩa thống kê.
40
4.3 TỈ LỆ VÀ MỨC ĐỘ BỆNH VIÊM VÖ CẬN LÂM SÀNG TRÊN ĐÀN BÕ SỮA
Bảng 12: Tỉ lệ viêm vú cận lâm sàng khảo sát bằng phƣơng pháp CMT Địa điểm Số bò thử CMT (con) Số vú khảo sát Số bò thử CMT Dƣơng tính TL(%) Số vú khảo sát Dƣơng tính TL(%) Trang trại tập trung 128 74 57,81 a 512 184 35,94a Hộ gia đình 120 39 32,50b 480 97 20,21b Tổng cộng 248 113 45,56 992 281 28,33
a,b: Các giá trị trong cùng một cột mang các số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê,