E.coli thuộc họ Enterobacteriaeceae đƣợc Escherich ngƣời Đức phân lập đầu tiên và đƣa ra đặc điểm của vi khuẩn vào năm 1885. E.coli là loài quan trọng đƣợc tìm thấy trong phân (Nguyễn Vĩnh Phƣớc et al., 1977).
(http://www.biology.ele.ue.edu/.../Gram_Stain/Gram_Stain.htm ;
http://www.maxine-log.blogspot.com/2007_08_01_archive.html)
Hình 6: Vi khuẩn E.coli trên kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử
21
a. Đặc điểm hình thái
E.coli là trực khuẩn hình gậy ngắn, kích thƣớc 2x0,6 – 3x 0,6 µm. Trong cơ thể có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Phần lớn E.coli có khả năng di động do có lông xung quanh thân. Vi khuẩn không sinh nha bào, có thể có giáp mô.
Vi khuẩn bắt màu Gram âm, có thể bắt màu đều hay sẫm ở hai đầu, khoảng giữa nhạt hơn (Nguyễn Nhƣ Thanh et al., 1997).
b. Đặc tính nuôi cấy
E.coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện, nhiệt độ thích hợp là 370C, có thể sống ở 10-46 0
C. Mọc dễ dàng trên môi trƣờng MacConkey (MC).
Một số hóa chất ức chế sự phát triển của E.coli nhƣ chlorine và dẫn xuất của nó (Nguyễn Thanh Bảo, 2006).
Trên thạch thƣờng sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc tròn, ƣớt không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đƣờng kính 2-3 mm. Nuôi lâu thì khuẩn lạc màu nâu nhạt (Nguyễn Nhƣ Thanh et al., 1997).
Trong môi trƣờng nƣớc thịt thì E.coli làm môi trƣờng rất đục, có cặn lắng xuống đáy, đôi khi có mảng màu xám nhạt trên mặt, môi trƣờng sẽ có mùi thối (Nguyễn Nhƣ Thanh et al., 1997).
Trên môi trƣờng EMB thì E.coli hình thành những khuẩn lạc to tròn, hơi lồi, bóng, màu tím bầm, có ánh kim (Trần Thị Phận, 2004).
Trên môi trƣờng MC E.coli hình thành khuẩn lạc to tròn đều, hơi lồi, màu hồng nhạt, kích thƣớc 2-3 mm (Nguyễn Vĩnh Phƣớc et al., 1977).
c. Sức đề kháng
Vi khuẩn E.coli không hình thành nha bào nên sức đề kháng yếu, bị tiêu diệt ở nhiệt độ 550C trong vòng 1 giờ, ở 600C vi khuẩn sống trong 15-30 phút. Các chất sát trùng nhƣ acid phenic, clorua, formol có thể diệt vi khuẩn trong vòng 5 phút, nhƣng vi khuẩn đề kháng mạnh với sự khô (Lê Văn Tạo, 2006).
d. Tính gây bệnh
Trong tự nhiên
Hầu hết các loài động vật đều mẫn cảm với bệnh nhƣ: các loài gia súc, gia cầm, chim, bò sát đều có thể bị bệnh do E.coli. Chúng bị nhiễm bệnh qua nhiều con đƣờng khác nhau nhƣng chủ yếu là đƣờng tiêu hóa (Đào Trọng Đạt, 2001).
E.coli có sẵn trong ruột của tất cả các động vật nhƣng chỉ có tác dụng gây bệnh khi sức đề kháng của con vật giảm sút do chăm sóc, nuôi dƣỡng, bị cảm lạnh hay cảm
22
nắng, mắc các bệnh không truyền nhiễm hay các bệnh truyền nhiễm và các bệnh ký sinh trùng.
E.coli thƣờng gây bệnh cho gia súc mới đẻ từ 2-3 ngày hoặc 4-8 ngày. Trong phòng thí nghiệm:
Tiêm vi khuẩn vào dƣới da cho chuột bạch, chuột lang, thỏ có thể gây viêm cục bộ, nếu tiêm với liều lớn có thể gây bại huyết, làm chết con vật (Nguyễn Nhƣ Thanh et al., 1997).
e. Chẩn đoán
Dùng bệnh phẩm cấy trên môi trƣờng phân lập, quan sát hình thái trên tiêu bản, làm các phản ứng huyết thanh ngƣng kết và phản ứng sinh hóa sau đó thử độc lực trên động vật thí nghiệm (Nguyễn Nhƣ Thanh et al., 1997).
f. Nhạy cảm đối với kháng sinh
Theo Bùi Thị Tho (2003), kết quả kiểm tra tính kháng thuốc của vi khuẩn phân lập từ heo con bệnh phân trắng của trƣờng Đại Học Nông Nghiệp 1 (Hà Nôi) từ năm 1976 đến nay cho thấy tỷ lệ kháng thuốc của E.coli đối với Chloramphenicol là 25,78% với Chlortetracyxlline là 23,21%, với Streptomycin và Sulphonamide lần lƣợt là 77,07% và 89,97%.
Theo Đỗ Ngọc Thúy, (2002) thử tính kháng sinh của 106 chủng E.coli, chọn ra từ 323 gốc phân lập đƣợc từ heo tiêu chảy ở 4 trại heo miền bắc, dùng E.coli ATCC 25922 làm đối chứng, nhận thấy các chủng đề kháng mạnh với các kháng sinh thông thƣờng vẫn sử dụng điều trị bệnh: Amoxicillin (76,42%), Streptomycin (88,68%) và Tetracycline (97,17%) phổ biến là đa kháng với trên 3 loại kháng sinh (90,57%), các biệt có 3 chủng (2,83%) đề kháng với 13 trong số 14 loại kháng sinh đƣợc kiểm tra.
Theo Nguyễn Ngọc Thanh Hà (2004), E.coli nhạy cảm với Ciprofloxacin (100%), Gentamycin (100%), Neomycin (100%), Ofloxacin (100%), Kanamycin (100%), Ampicillin (86,67%), Bactrim (80%).
g. Nguồn lây bệnh viêm vú do E.coli
Khoảng 30% bệnh viêm vú lâm sàng là do các vi khuẩn đƣờng ruột và đặc biệt là 27% do E.coli trong trƣờng hợp nhiễm trùng, phản ứng viêm rất rõ, thƣờng ở thể lâm sàng đôi khi nguy kịch (Pierre Brouillet và Bernard Faroult, 2003).
23
CHƢƠNG 3
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Viêm vú lâm sàng và viêm vú cận lâm sàng.
3.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
Thời gian: tháng 06-12/2013
Địa điểm: Đề tài đƣợc thực hiện tại các hộ chăn nuôi và trang trại bò sữa tại Long An, Sóc Trăng.
Nuôi cấy phân lập vi khuẩn: Phòng vi sinh Công ty Vemedim.
3.3. PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 3.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu
- Bò sữa đang cho sữa ở tỉnh Long An và Sóc Trăng
3.3.2 Mẫu bệnh phẩm
- Sữa viêm dùng để phân lập gồm các mẫu sau:
Bảng 1 : Số lƣợng mẫu bệnh phẩm lấy từ bò bị viêm vú lâm sàng ở tỉnh Sóc Trăng và Long An để phân lập vi khuẩn.
Địa điểm Loại mẫu Số mẫu
Trang trại tập trung Nông hộ Tổng cộng Sữa Sữa 7 2 9
24
3.3.3 Số con kiểm tra CMT
Bảng 2: Số con bò thử CMT ở tỉnh Sóc Trăng và Long An
Địa điểm Loại mẫu Số con thử CMT
Trang trại tập trung Nông hộ Tổng cộng Sữa Sữa 128 120 248
3.3.4 Số con điều trị bệnh viêm vú lâm sàng. Bảng 3: Số con bò điều trị bệnh viêm vú Bảng 3: Số con bò điều trị bệnh viêm vú
Địa điểm Số lƣợng (con)
Trang trại tập trung Long An 49
Nông hộ ở Sóc Trăng 59
Tổng cộng 108
3.3.5 Thuốc điều trị
Thuốc bơm vú:
CEQUIN for LC, Ceptifi for LC, thuốc bơm vú bò…. Thuốc tiêm.
Ceptiket, Ketovet, Preso, Canxi – B12, Cequin 250
3.3.6 Dụng cụ và hóa chất
Dụng cụ tiêm chích: Kim tiêm số 18, ống tiêm loại 25ml
Dụng cụ phòng thí nghiệm: găng tay, kéo, ống đong, ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn, tâm bong vô trùng, cân điện tử, thùng trữ mẫu, tủ ấm, tủ sấy, autoclave, kính hiển vi, buồng cấy vô trùng….
Hóa chất: cồn 700, thuốc thử California Mastitis Test (CMT), Methylen Blue
Môi trƣờng nuôi cấy: Nutrent Agar (NA), MacConkey Agar (MC), Blood Agar (BA), Mannitol Salt Agar (MSA), Tryptycase Soy Agar (TSA), Eosin Methylene Blue Agar (EMB), Kligler Iron Agar (KIA), Mueller Hinton Agar (MHA), Methyl Red – Voges ProsKauer (MR-VP).
3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1 Viêm vú lâm sàng 3.4.1 Viêm vú lâm sàng
25
Lấy thân nhiệt
Biểu hiện vú viêm: nóng, đỏ, sƣng, đau, cứng Bỏ ăn……
Ta cũng có thể phát hiện bằng mắt thƣơng và cũng có thể dùng CMT để thử
3.4.2 Viêm vú cận lâm sàng (CMT)
Phƣơng pháp thử CMT (California Mastitis Test)
Dùng thuốc thử Leucocytest (có màu tím) thử sữa từ mỗi thùy vú của bò, theo tỉ lệ sữa và thuốc thử là 1:1 (2ml sữa :2ml thuốc thử). Đây là phản ứng bán định lƣợng để đánh giá sự hiện diện của tế bào bạch cầu trong sữa.
Cách tiến hành
Đầu tiên rửa bầu vú, sau đó dùng khăn ấm lau cho sạch bầu vú, vắt bỏ những giọt sữa đầu tiên trên từng thùy vú nhằm tránh tạp khuẩn. Sau đó trên mỗi thùy vú lấy 2ml sữa cho vào 1 trong 4 đĩa trong khai theo thứ tự trƣớc trái (A), trƣớc phải (B), sau trái (C), sau phải (D), sau đó cho thêm 2 ml thuốc thử vào các đĩa trên khay đã vắt 2ml sữa vào đó, lắc nhẹ qua lại vài lần để cho sữa và thuốc thử trộn vào nhau. Sau đó quan sát và đọc kết quả.
26
Bảng 4: Đánh giá kết quả CMT (Lý Thị Liên Khai,1999)
Độ đồng nhất Màu sắc Kết quả Chẩn đoán
Không lợn cợn Màu xám (-) Bình thƣờng
Hơi lợn cợn, độ đặc quánh rất ít, tan
Màu xám hơi ngã tím
(+) Nghi ngờ, có nguy cơ nhiễm
Vón cục, độ đặc quánh ít, không tan
Màu xám tím (++) Viêm vú cận lâm sàng
Đóng vón dày, thành từng đám nhớt
Màu tím (+++) Viêm vú cận lâm sàng
Đóng vón dày giống lòng trắng trứng
Màu tím đậm (++++) Trầm trọng, ranh giới giữa viêm vú cận lâm sàng và lâm sàng
Bảng 5: Giải thích kết quả CMT ( Lý Thị Liên Khai, 1999)
Điểm số Mức độ nhiễm Số lƣợng tế bào/ml sữa
0(-) 1(1+) 2(2+) 3(3+) 4(4+) Không
Có nguy cơ nhiễm với số lƣợng ít Viêm vú cận lâm sàng
Viêm vú cận lâm sàng
Ranh giới giữa viêm vú cận lâm sàng và lâm sàng
100.000 300.000 900.000 2.700.000 8.100.000
27
3.4.3 Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Phƣơng pháp lấy mẫu Phƣơng pháp lấy mẫu
Mẫu sữa: làm vệ sinh bò trƣớc khi lấy mẫu, dùng khăn ấm lau sạch bầu vú. Vắt bỏ vài tia sữa đầu bằng tay sau đó vắt sữa cho vào túi nylon, ghi lại ký hiệu, ngày lấy mẫu. Sau đó sữa đƣợc bảo quản lạnh và đem về phòng thí nghiệm để cấy và phân lập vi khuẩn
3.4.3.1 Vi khuẩn Staphylococcus aureus
Trên môi trƣờng MSA: khuẩn lạc Staphylococcus aureus tròn, màu vàng, rìa gọn, khô, lồi, môi trƣờng chuyển từ màu đỏ sang vàng.
Vi khuẩn đƣợc cấy thuân trên môi trƣờng NA, sau đó tiến hành kiểm tra các phản ứng sinh hóa. Quy trình nuôi cấy và phân lập vi khuẩn đƣợc thể hiện qua sơ đồ.
Bảng 6: Đặc tính sinh hóa đặc trƣng của vi khuẩn Staphylococcus aureus
Vi khuẩn Sinh men catalase Đông huyết tƣơng thỏ Dung huyết
Staphylococcus aureus + + +
Hình 14: Staphylococcus aureus làm đông huyết tƣơng thỏ
Ống 1,2: Đông huyết tƣơng thỏ Ống 3,4: Ống đối chứng
1 2 3 4
Hình 13: Lấy mẫu sữa viêm cho vào túi nylon
28
Sơ đồ 1: Quy trình phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus
(Nguyễn Nhƣ Thanh et al., 1997).
Phản ứng đông huyết tƣơng thỏ ( ) Phản ứng Catalase (+) Phản ứng dung huyết (+) Staphylococcus aureus Kháng sinh đồ 370C 24 giờ 370C 24 giờ 370C 24 giờ
Phân lập trên môi trƣờng MSA
Kiểm tra đặc tính sinh hóa
370C 24 giờ. Khuẩn lạc
S.aureus tròn, màu vàng, rìa gọn, khô
Nhuộm Gram cầu khuẩn Gram ( )
Cho mẫu bệnh phẩm vào môi trƣờng NB
370C 24 giờ.
29
3.4.3.2 Vi khuẩn Streptococcus agalactiae
Trên môi trƣờng BA: khuẩn lạc nghi là Streptococcus agalactiae có hình dạng tròn, nhỏ li ti, giống nhƣ hạt sƣơng và làm tiêu huyết môi trƣờng.
Vi khuẩn đƣợc cấy thuần trên môi trƣờng NA, sau đó tiến hành kiểm tra các phản ứng sinh hóa. Quy trình nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Streptococcus agalactiae đƣợc thực hiện qua sơ đồ.
Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus agalactiae: Phản ứng Catalase (-).
Môi trƣờng NaCl 6,5%, pH = 9,6: Streptococcus agalactiae làm đục môi trƣờng NaCl 6,5%.
Hình 15: Streptococcus làm đục môi trƣờng NaCl 6,5%
Ống 1: Ống đối chứng
Ống 2: Streptococcus làm đục môi trƣờng NaCl 6,5% 1 2
30
Sơ đồ 2: Quy trình phân lập vi khuẩn Streptococcus agalactiae
(Nguyễn Nhƣ Thanh et al., 1997).
Phản ứng Catalase (-) Phát triển trong NaCl 6,5%, pH 9,6
Streptococcus agalactiae
Kháng sinh đồ
370C 24 giờ
370C 24 giờ
Phân lập trên thạch máu BA
Kiểm tra đặc tính sinh hóa
370C 24 giờ. Khuẩn lạc tròn, nhỏ li ti, trong nhƣ hạt sƣơng và làm tiêu huyết môi trƣờng
Nhuộm Gram liên cầu khuẩn Gram ( )
Cho mẫu bệnh phẩm vào môi trƣờng NB
370C 24 giờ.
31
3.4.3.3 Vi khuẩn E.coli
Trên môi trƣờng EMB: khuẩn lạc E.coli to, tròn, hơi lồi, bóng, màu tím ánh kim. Vi khuẩn đƣợc cấy thuần trên môi trƣờng NA, sau đó tiến hành kiểm tra các phản ứng sinh hóa. Quy trình nuôi cấy, phân lập vi khuẩn E.coli đƣợc thực hiện qua sơ đồ.
Bảng 7: Đặc tính sinh hóa đặc trƣng của vi khuẩn E.coli
Vi
khuẩn Lactose/glucose H2S Gas Citrate Di
động VP MR Indol
E.coli +/+ - + - + - + +
32
Sơ đồ 3: Quy trình phân lập vi khuẩn E.coli. (Nguyễn Nhƣ Thanh et al., 1997).
KIA
Escherichia coli
Kháng sinh đồ Phân lập trên môi trƣờng
EMB
Kiểm tra đặc tính sinh hóa
370C 24 giờ. Khuẩn lạc to tròn, hơi lồi bóng, có màu tím ánh kim
Nhuộm Gram trực khuẩn Gram (-)
Cho mẫu bệnh phẩm vào môi trƣờng NB 370C 24 giờ. Mẫu bệnh phẩm (sữa) Indol (+) MR VP(+) Simmons Citrate (-) Glucose (+) Lactose (+) H2S(-)
33
3.4.4 Thực hiện kháng sinh đồ
Kiểm tra tính nhạy của kháng sinh đối với các vi khuẩn nhƣ: Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, E.coli dựa trên nguyên tắc kháng sinh từ đĩa giấy sẽ khuếch tán làm ức chế vi sinh vật kiểm nghiệm, từ đó sẽ tạo nên vòng vô khuẩn quanh đĩa giấy kháng sinh.
Môi trƣờng
Môi trƣờng tiêu chuẩn là môi trƣờng MHA. Bề dày của thạch khoảng 4mm, pH từ 7,2 đến 7,6 ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.
Chuẩn bị canh khuẩn:
Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, E.coli đã qua phản ứng sinh hóa dƣơng tính, đƣợc cấy thuần trên môi trƣờng NA, chuyển khuẩn lạc vào ống có chứa 9ml nƣớc muối sinh lý 9%o sao cho canh khuẩn có độ đục tƣơng đƣơng độ đục ống chuẩn Mc. Farland 0,5 (tƣơng đƣơng 10 8
CFU/ml).
Các đĩa kháng sinh: Cequinome, Ceftiofur, Marbofloxacin, Doxycycline,
Florfenicol, Fosfomycin, Gentamycin, Enrofloxacin, Norfloxacin, Danofloxacin. Phƣơng pháp làm kháng sinh đồ
Dùng Micropipet hút 100 µl canh khuẩn cho vào đĩa thạch, dùng cây tran trang đều vi khuẩn trên mặt thạch MHA tran đến khi mặt thạch khô, dùng kẹp vô trùng lấy các đĩa kháng sinh đặt lên mặt thạch. Khi đặt phải đè nhẹ để đĩa kháng sinh tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch. Khi đặt đĩa kháng sinh ta phải đảm bảo các đĩa không gân nhau dƣới 24mm. kháng sinh khuếch tán ngay sau khi đĩa kháng sinh chạm vào mặt thạch. Vì vậy khi đặt phải chính xác và không dời đổi các đĩa kháng sinh. Ủ đĩa thạch ở 37o
C, sau 16 – 24 giờ sau đó đọc kết quả ( Phạm Hùng Vân, 2002). Đọc kết quả kháng sinh đồ.
Kết quả kháng sinh đƣợc kết luận bằng cách so sánh với bảng đƣờng kính chuẩn ở bảng 7 và 8
34
Bảng 8: Đƣờng kính vòng vô khuẩn chuẩn của một số kháng sinh đối với vi khuần Staphylococcus aureus và Streptococcus agalatiae (NCCLS, 2004; CLSI, 2012) Kháng sinh Kí hiệu Hàm lƣợng kháng sinh/ đĩa (µg) Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) Kháng (≤) Trung bình Nhạy (≥) Ceftiofur Xnl 30 17 18-20 21 Cefquinome C10 10 15 16-21 22 Marbofloxacin Mar 5 14 15-19 20 Doxycycline Do 30 12 13-15 16 Florfenicol Ffc 30 14 15-18 19 Fosfomycin Fos 50 12 13-15 16 Gentamycin Ge 10 12 13-14 15 Enrofloxacin Enr 5 16 17-22 23 Norfloxacin Nr 10 12 13-16 17 Danofloxacin Dn 30 12 13-15 16
Bảng 9: Đƣờng kính vòng vô khuẩn chuẩn của một số kháng sinh đối với vi khuần E.coli (NCCLS, 2004; CLSI, 2012)
Kháng sinh Kí hiệu Hàm lƣợng kháng
sinh/ đĩa (µg) Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm)
Kháng (≤) Trung bình Nhạy (≥) Ceftiofur Xnl 30 17 18-20 21 Cefquinome C10 10 15 16-21 22 Marbofloxacin Mar 5 14 15-19 20 Doxycycline Do 30 10 11-13 14 Florfenicol Ffc 30 14 15-18 19 Fosfomycin Fos 50 12 13-15 16 Gentamycin Ge 10 12 13-14 15 Enrofloxacin Enr 5 16 17-22 23 Norfloxacin Nr 10 12 13-16 17 Danofloxacin Dn 30 10 11-13 14
35
3.4.5 Thử nghiệm điều trị
Bố trí thí nghiệm
Bố trí các con bệnh vào các phác đồ điều trị khác nhau, để xem hiệu quả của phác đồ nào có hiệu quả nhất.
Bảng 10: Bố trí phác đồ điều trị viêm vú Địa điểm Số con điều trị Các phác đồ Phác đồ 1 Phác đồ 2 Phác đồ 3 Phác đồ 4 Trang trại tập trung 49 5 14 30 0 Hộ gia đình 59 20 25 1 13 Tổng cộng 108 25 39 31 13 Chú thích:
- Phác đồ 1: Chỉ vắt sữa nhiều lần (3 giờ vắt 1 lần liên tục 3-5 ngày)
- Phác đồ 2: Thuốc bơm Ceptifi for LC (1 ống 10ml thùy vú ngày trong 3 – 5 ngày)
- Phác đồ 3: Thuốc bơm vú bò (5ml/ vú/ ngày, trong 3 ngày) + Ceptiket, Ketovet, Canci B12 (1ml 25kg thể trọng tiêm trong 3-5 ngày).
- Phác đồ 4: Thuốc bơm Cequin for LC (1 ống thùy vú bơm 3 lần liên tục cách nhau 12 giờ) Cequin 250 (1ml/25kg/ngày tiêm 3-5 ngày)
- Thành phần của thuốc xem trong phần phụ lục
Phƣơng pháp tiến hành điều trị viêm vú.
Bƣớc đầu tiên ta rửa bầu vú sau đó ta dùng khăn nhúng nƣớc ấm lau lại bầu vú cho sạch. Ta vắt vú bị viêm cho hết sữa, dùng thuốc điều trị viêm vú bơm vào núm vú. Khi đƣa thuốc vào ta phải nặn cho ra một ít thuốc để cho đầu thuốc trơn để tránh