Mẫu mắa bệnh chồi cỏ mắa thu ựược tại Nghệ An, Việt Nam và mẫu mắa bệnh chồi cỏ mắa và trắng lá mắa thu tại Sri Lanka ựã ựược chiết suất DNA và chạy PCR sử dụng các cặp primer ựặc hiệu của gene SecẠ Sản phẩm PCR ựược giải mã và phân tắch. Dựa trên trình tự gen secA, Phytoplasma gây bệnh chồi cỏ mắa và trắng lá mắa hình hình một nhóm hoàn toàn tách biệt so với một số Phytoplasma khác trong nhóm 16SrXI như NGS (EU168750), BGWL (FJ755004) (Hình 3.30). Trình tự gen secA của tất cả Phytoplasma ựều giống nhau cho dù ựược khuyếch ựại từ mẫu cây mắa biểu hiệu triệu chứng chồi cỏ mắa thu tại Việt Nam hay triệu chứng chồi cỏ mắa và trắng lá mắa thu từ Srilanka từ các vùng sinh thái khác nhaụ Hodgetts et al. (2008) ựã chứng minh trình tự ựoạn gen SecA có thể ựược sử dụng ựể phân loại Phytoplasma chi tiết hơn so với việc sử dụng ựoạn 16-23SrRNA hoặc ựoạn gen 16SrRNẠ Thực tế ựã ựược chứng minh là chỉ có một phiên bản gene SecA trong bộ genome của Phytoplasma, trong khi ựó có tới 2 phiên bản của gen rRNA, do ựó, việc sử dụng gen SecA sẽ loại bỏ khả năng bị lẫn giữa 2 phiên bản của rRNẠ Theo Tran-Nguyen triệu chứng bệnh Phytoplasma chỉ xuất hiện khi gặp ựiều kiện môi trường cụ thể nào ựó chiếm ưu thế hoặc khi có sự có mặt của một số tác nhân gây bệnh khác (Tran- Nguyen et al., 2000).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 71
Hình 3.30. Cây phả hệ thể hiện mối tương quan giữa các Phytoplasma gây bệnh trên mắa và cỏ dựa trên trình tự gen SecẠ
Mẫu mắa biểu hiện triệu chứng chồi cỏ thu tại Nghệ An, Việt Nam và một số mẫu mắa biểu hiện triệu chứng chồi cỏ mắa và trắng lá mắa thu tại Sri Lanka ựược chiết suất DNA và chạy PCR bằng cặp primer ựặc hiệu của gen SecẠ Sản phẩm PCR ựược giải mã và phân tắch trình tự ựoạn gen SecẠ
3.2.4. Phân tắch trình tự ựoạn gen 16SrRNA
Tổng số 60 mẫu mắa biểu hiện bệnh chồi cỏ thu tại Nghệ An và mẫu mắa biểu hiện triệu chứng chồi cỏ và trắng lá thu từ Sri Lanka ựã ựược sử dụng cho phản ứng PCR. Tất cả các mẫu biểu hiện triệu chứng ựều có phản ứng dương với các cặp primer R16F2n/R16R2 với chiều dài sản phẩm PCR khoảng 1200bp. Trong khi ựó không có sản phẩm PCR nào ựược khuyếch ựại từ mẫu cây không biểu hiện triệu chứng (hình 3.31).
Kiểm tra mức ựộ tương ựồng gen cho thấy mẫu mắa biểu hiện triệu chứng chồi cỏ mắa, trắng lá mắa thu tại Việt Nam và mẫu chồi cỏ mắa và trắng lá mắa thu Sri Lanka có mức ựộ tương ựồng gen cao trên 90% với Phytoplasma gây
SCWL2 Sri Lanka SCGS1 Sri Lanka SCGS India (DQ459440) SCGS1 Vietnam SCGS2 Sri Lanka SCGS2 Vietnam SCGS India (AM261835) SCWL1 Sri Lanka SCGS India (AM261834)
16SrXI Napier Grass Stunt (EU168750) 16SXIV Malaysian BGWL (FJ755004) Bermudagrass2 Sri Lanka
Bermudagrass1 Sri Lanka Bermudagrass3 Sri Lanka
Cạ Phytoplasma asteris 16SrI secA (CP000061) 87
100 100
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 72 bệnh chồi cỏ mắa tại Ấn độ (AM261831), và Phytoplasma gây bệnh trắng lá mắa tại Thái Lan (AB052874).
Các kết quả nghiên cứu trên ựã khẳng ựịnh các Phytoplasma gây bệnh chồi cỏ mắa và trắng lá mắa ở Việt nam ựều thuộc nhóm RYD 16SrXI của ỔCandidatus Phytoplasma oryzaeỖ.
Hình 3.31. Cây phả hệ thể hiện mối tương quan giữa các Phytoplasma gây bệnh trên mắa và cỏ dựa trên trình tự gen 16SrRNẠ
Mẫu mắa thu tại Nghệ An, Việt Nam và một số mẫu mắa biểu hiện triệu chứng chồi cỏ mắa và trắng lá mắa thu tại Sri Lanka ựược chiết suất DNA và chạy PCR bằng 2 cặp primer P1/P7 và R16F2n/R16R2. Sản phẩm PCR ựược giải mã và phân tắch trình tự ựoạn gen 16SrRNẠ
SCGS2 Sri Lanka
Weligama wilt of coconut Sri Lanka (EU635503) SCGS India (DQ459439)
Kerala wilt of coconut India (GQ850122) SCWL Thailand (AB052874) SCGS1 Vietnam SCGS1 Sri Lanka SCGS India (AM261831) SCWL1 Sri Lanka SCWL2 Sri Lanka Ca Phytoplasma oryzae (D12581)
Cạ Phytoplasma cynodontis 16SrXIV (AJ550984) Bermudagrass 1 Sri Lanka
XI Napier grass stunt (AY377876)
Cạ Phytoplasma asteris 16SrI (EU921446) 99
55 97
100
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 73
KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ Kết luận
1. Bệnh chồi cỏ mắa phân bố chủ yếu ở Nghệ An trên các giống ROC 10 và MY55-14; bệnh trắng lá mắa phân bố chủ yếu ở Bình Dương trên giống ROC 10. 2. đã phát hiện ựược các thể Phytoplasma có dạng hình cầu hay hình ô van dưới kắnh hiển vi ựiện tử trong mô các cây mắa bị bệnh chồi cỏ và trắng lá thu ở Nghệ An, Bình Dương.
3. Phương pháp nested-PCR sử dụng cặp primer P1/P7-R16F2n/R16R2 ở ựiều kiện 5 phút khởi ựầu ở 95oC, tiếp theo 35 chu kỳ với 95oC trong 30 giây, 55oC trong 1 phút, 72oC trong 2 phút và giai ựoạn kéo dài trong vòng 10 phút ở nhiệt ựộ 72oC là ựiều kiện tối ưu ựể phát hiện Phytoplasma gây bệnh chồi cỏ, trắng lá mắạ
4. Trình tự gen của Phytoplasma gây bệnh chồi cỏ mắa ở Nghệ An tương ựồng 99% với trình tự gen của bệnh chồi cỏ mắa ở Ấn ựộ. Trình tự gen của Phytoplasma gây bệnh trắng lá mắa ở Bình Dương trùng 100% với trình tự gen bệnh trắng lá mắa ở Thái Lan. Phytoplasma gây bệnh chồi cỏ mắa ở Nghệ An và bệnh trắng lá mắa ở Bình Dương thuộc nhóm phụ SCGS và SCWL, tương ứng và ựều thuộc nhóm 16SrXỊ
đề nghị
1. Ứng dụng phương pháp nested-PCR sử dụng cặp primer P1/P7- R16F2n/R16R2 vào chẩn ựoán Phytoplasma gây bệnh chồi cỏ và trắng lá mắa ở Việt Nam. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2. Tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện kỹ thuật nested- PCR ựể phát hiện và chẩn ựoán các Phytoplasma gây hại trên cây trồng.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 74
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Vũ Triệu Mân, Nguyễn Kim Giao, Nguyễn Thị Minh Liên, Nguyễn Thanh Thuỷ, đỗ Ngọc Diệp và Cao Anh đương (2002), ỘMột số nghiên cứu bệnh trắng lá mắaỢ, Hội thảo bệnh cây và sinh học phân tử, đại học Nông Lâm T/P Hồ Chắ Minh, 23-25.
2. Viện Bảo vệ thực vật, (1997), Phương pháp ựiều tra phát hiện dịch hại, NXB Nông nghiệp.
3. http://www.kilobooks.com/nguon-goc-cay-miạ 4. http://vịwikipediạorg/wikị
5. http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Sugarcane_mosaic_virus
Tài liệu tiếng Anh
6. Ariyarathna H.ẠC.K, Everard J.M.D.T & Karunanayake ẸH. (2007), ỘDiseased sugarcane in Sri Lanka is infected with sugarcane grassy shoot and/or sugarcane white leaf phytoplasmaỢ, Australian Plant Disease Notes, 2, 123-125.
7. Arocha Y, López M, Fernández M, Piựol B, Horta D, Peralta ẸL, Almeida R, Carvajal O, Picornell S, Wilson M.R, Jones P (2005), ỘTransmission of a sugarcane yellow leaf phytoplasma by the delphacid planthopper Saccharosydne saccharivora, a new vector of sugarcane yellow leaf syndromeỢ, Plant Pathology , 54, 634-642.
8. Bertaccini A (2007), ỘPhytoplasmas, diversity, taxonomy, and epidemiologyỢ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 75 9. Bergeys R., M. Rott and Ẹ Seemủller, 2004. Range of phytoplasma concentration in various plant hosts as determined by competitive polymerase chain reaction. Phytopathology 90, 1145-1152.
10. Bertaccini A, Paltrinieri S, Contaldo N, Duduk B, Nahdi S, Benni A and Bellardi M.G. (2009), ỘDifferent phytoplasmas infecting purple coneflower in ItalyỢ, In: Abstracts, XV Convegno Nazionale Società Italiana di Patologia Vegetale, 28 SettembreỜ1 Ottobre 2009, Locorotondo (Bari), Italỵ
11. Bressan A and Purcell ẠH. (2005), ỘEffect of benzothiadiazole on transmission of a disease phytoplasma by the vector Colladonus montanus to Arabidopsis thiliana, a new experimental host plantỢ, Plant Disease, 89, 1121-1124.
12. Burgess L. (2010) Sugarcane diseases in Laos. The Crawford Fund. http://www.crawfordfund.org/states/nsw/news/sugarcanẹhtml. Accessed 15 March 2012
13. Chandrasene G, Brune ẠE, Rutherford R.S, Dharmawardena N (2003), ỘDetection of phytoplasmas associated with grassy shoot and white leaf diseases of sugarcane in Sri Lanka using FTA TM PapersỢ Sugar Tech, 5, 237-241.
14. Chona B.L, Capoor S.P, Varma P.M, Seth M.L. (1960), Ộ"Grassy-shoot" disease of sugarcaneỢ, Indian Phytopathology, 13, 37-47.
15. Chen C.T. (1973), ỘSugarcane white leaf disease in Thailand and TaiwanỢ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 76 16. Chen K.H, Redi R.C, Loi N, Maixner M and Chen T.Ạ (1994), ỘIdentification and grouping of mycoplasma like organisms associated with grapevine yellows and clover phyllody diseases based on immunological and molecular analysesỢ, Applied and Environmental Microbiology, 60, 1905-1913.
17. Christensen N.M, Axelsen K.B, Nicolaisen M and Schultz A (2005), ỘPhytoplasmas and their interactions with their hostsỢ, Trend in Plant Science, 10, 526Ờ535.
18. Deng S, Hiruki C (1991), ỘAmplification of 16S rRNA genes from culturable and non culturable mollicutesỢ, Journal of Microbiological Methods, 14, 53-61.
19. Doi Y, Teranaka M, Yora K and Asuyama H (1967), ỘMycoplasma or PLT grouplike microrganisms found in the phloem elements of plants infected with mulberry dwarf, potato witchesỖ broom, aster yellows or pawlonia witchesỖ broomỢ, Annals of Phytopathological Society Japan, 33, 259Ờ 266.
20. Doyle J.J and Doyle J.L (1990), ỘIsolation of plant DNA from fresh tissueỢ, Focus, 12, 13-15.
21. Durrant W.E and Dong X (2004), ỘSystemic acquired resistanceỢ, Annual Review of Phytopathology, 42, 185-209.
22. Edison S, Ramakrishnan K, Narayanasamy P (1976), ỘComparison of grassy shoot disease (India) with the white leaf disease (Taiwan) of sugarcaneỢ,
Sugarcane Pathology, Newsletter, 17, 30-35.
23. Griffiths H.M, Gundersen D.E, Sinclair W.A, Lee I-M and Davis R.Ẹ (1994), ỘMycoplasma like organism from milkweed, goldenrod, and
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 77 spirea represent two new 16S rRNA subgroups and three new strain subclusters related to peach X- diseaseỢ, Canadian Jounal of Plant Pathology, 16, 255-266.
24. Gundersen D.E, Lee I-M, Rehner S.A, Davis R.E and Kingsbury D.T. (1994), ỘPhylogeny of mycoplasmalike organisms (phytoplasmas): a basis for their classificationỢ, Journal of Bacteriology, 176, 5244Ờ5254. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
25. Gundersen D.E, Lee I-M, Schaff D.A, Harrison N.A, Chang C.J, Davis R.E and Kinsbury D.T. (1996), ỘGenomic diversity among phytoplasma strains in 16S rRNA Group I (Aster Yellows and related phytoplasmas) and III (X-Disease and related phytoplasmas)Ợ, International Journal of Systematic Bacteriology, 46, 64Ờ75.
26. Hanboonsong Y, Choosai C, Panyim S & Damak S (2002), ỘTransovarial transmission of sugarcane white leaf phytoplasma in the insect vector Matsumuratettix hiroglyphicus (Matsumura)Ợ, Insect Molecular Biology,
11, 97-103.
27. Hanboonsong Y, Ritthison W, Choosai C & Sirithorn P (2006), ỘTransmission of sugarcane white leaf phytoplasma by Yamatotettix flavovittatus, a new leafhopper vectorỢ, Journal of Economic Entomology,
99, 1531-1537.
28. Hammerschmidt R (2009), ỘSistemic acquired resistanceỢ, Advances in Botanical Research, 51, 173-222.
29. Harrison N.A, Richardson P.A, Kramer J.B and Tsai J.H. (1994), ỘDetection of the mycoplasma-like organism associated with lethal yellowing disease of palms in Florida by polymerase chain reactionỢ, Plant Pathology, 43, 998Ờ1008.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 78 30. Harrison N.A, Carpio M.L and Boa E (2006), ỘFirst report of Ộ Candidatus phytoplasma asteris-relate strains infecting chinaberry trees with leaf yellowing symptoms in VietnamỢ, Plant Disease Notes, 90, 527.
31. Hodgetts J, Boonham N, Mumford R, Harrison N, and Dickinson M (2008), ỘPhytoplasma phylogenetics based on analysis of secA and 23S rRNA gene sequences for improved resolution of candidate species of ỔCandidatus PhytoplasmaỖỢ, Int J Syst Evol Microbiol, 58, 1826-1837. 32. Hodgetts J, Boonham N, Mumford R & Dickinson M (2009), ỘA panel of
real-time PCR assays for improved universal and group specific detection of phytoplasmas, based on the 23S rRNA geneỢ, Applied and Environmental Microbiology, 75, 2945-2950.
33. Hayat Q, Hayat S, Irfan M and Ahmad A (2010), ỘEffect of exogenous salicylic acid under changing enviroment: a reviewỢ, Environmental and Experimental Botany, 68, 14-25.
34. Kumarasinghe N.C. & Jones P (2001), ỘIdentification of white leaf disease of sugarcane in Sri LankaỢ, Sugar Tech, 3, 55-58.
35. Kirkpatrick B.C., B.C. Stenger, T.J. Morris and ẠH. Purcell, 1987. Cloning and detection of DNA from a nonculturable plant pathogenic mycoplasma-like organism. Science 238, 197Ờ200.
36. Lee ỊM, Davis R.E, Chen T-A, Chiykowski L.N, Fletcher J, Hiruki C and Schaff D.Ạ (1992), ỘA genotype-base system for identification and classification of mycoplasmalike organisms (MLOs) in the aster yellows MLO strain clusterỢ, Phytopathology, 82, 977-986.
37. Lee ỊM, Hammond R.W, Davis R.E & Gundersen D.Ẹ (1993), ỘUniversal amplification and analysis of pathogen 16S rDNA for classification and
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 79 identification of mycoplasmalike organismsỢ, Phytopathology, 83, 834- 842.
38. Lee ỊM, Gundersen D.E, Hammond R.W and Davis R.Ẹ (1994), ỘUse of mycoplasmalike organism (MLO) group-specific oligonucleotide primers for nested-PCR assays to detect mixed-MLO infections in a single host plantỢ, Phytopathology, 84, 559-566.
39. Lee ỊM, Gundersen-Rindal D.E, Davis R.E and Bartoszyk ỊM. (1998a), ỘRevised classification scheme of phytoplasmas based on RFLP analysis of 16S rRNA and ribosomal protein gene sequencesỢ, International Journal of Systematic Bacteriology, 48, 1153-1169.
40. Lee ỊM, Gundersen-Rindal D.E and Bertaccini A (1998b), ỘPhytoplasma: ecology and genomic diversityỢ, Phytopathology, 88, 1359Ờ1366.
41. Lee ỊM, Gundersen-Rindal D.E, Davis R.E & Bartoszyk ỊM. (1998), ỘRevised classification scheme of phytoplasmas based on RFLP analyses of 16S rRNA and ribosomal protein gene sequencesỢ, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 48, 1153-1169. 42. Lee ỊM, Davis R.E and Gundersen-Rindal D.Ẹ (2000), ỘPhytoplasmas:
phytopathogenic mollicutesỢ, Annual Review of Microbiology, 56, 1593- 1597.
43. Lee ỊM, Davis R.E & Gundersen-Rindal D.Ẹ (2000), ỘPhytoplasma: phytopathogenic mollicutesỢ, Annual Review of Microbiology, 54, 221- 255.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 80 45. Matsumoto T, Lee C.H. & Teng W.S. (1968), ỘStudies on white leaf disease of sugarcane transmission by Epitettix hiroglyphicus MatsumuraỢ, Plant Protection Bulletin (Taiwan), 10, 3-9.
46. Marcone C (2002), ỘPhytoplasma diseases of sugarcaneỢ, Sugar Tech, 4, 79- 85.
47. McCoy R.E, Caudwell A, Chang C.J, Chen T.A, Chiykowski L.N, Cousin M.T, Dale J.L, de Leeuw G.T.N, Golino D.A & and other authors (1989), ỘPlant diseases associated with mycoplasmalike organismsỢ, Pages 545- 560 in: The Mycoplasmas, Vol. 5, Whitcomb R. F. and J. G. Tully, eds. Academic Press, New York.
48. Martini M, Lee I-M, Bottner K.D, Zhao Y, Botti S, Bertaccini A, Harrison N.A, Carraro L, Marcone C, Khan J and Osler R (2007), ỘRibosomal protein gene-based phylogeny for finer differentiation and classification of phytoplasmasỢ, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 57, 2037-2051.
49. Namba S, Kato S, Iwanami S, Oyaizu H, Shiozawa H & Tsuchizaki T (1993a),ỘDetection and differentiation of plant-pathogenic mycoplasmalike organisms using polymerase chain reactionỢ,
Phytopathology, 83, 786-791.
50. Namba S, Oyaizu H, Kato S, Iwanami S, & Tsuchizaki T (1993b), ỘPhylogenetic diversity of phytopathogenic mycoplasmalike organismsỢ,
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 43, 461-467. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
51. Nakashima K, Chaleeprom W, Wongkaew P & Sirithorn P (1994), ỘDetection of mycoplasma-like organisms associated with white leaf
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 81 disease of sugarcane in Thailand using DNA probesỢ, Japan International Research Center for Agricultural Sciences, 1, 57-67.
52. Nakashima K, Hayashi T, Chaleeprom W, Wongkeaw P & Sirithorn P (1996), ỘComplex phytoplasma flora in Northeast Thailand as revealed by 16S rDNA analysisỢ, Annals of the Phytopathologicial Society of Japan,
62, 57-60.
53. Pracros P, Renaudin J, Eveillard S, Mouras A and Hernould M (2006), ỘTomato flower abnormalities induced by stolbur phytoplasma infection are associated with changes of expression of floral development genesỢ,
Molecular Plant-microbe Interactions, 19, 62-68.
54. Rishi N, Chen C.T. (1989),. In Ricaud BC, Egan BT (ed), ỘThe diseases of sugarcane major diseases Grassy shoot and white leaf diseaseỢ. Elsevier Science Publisher, Amsterdam, pp 289-300.
55. Schneider B, Seemuller E, Smart C.D & Kikpatrick B.C. (1995), ỘPhylogenetic classification of plant pathogenic mycoplasma-like organisms or phytoplasmasỢ, pp. 369-380. In The Molecularand Diagnostic Procedures in Mycoplasmalogy. Edited by Razin S & Tully JG. San Diego, USA: Academic Press.
56. Sdoodee R, Schneider B, Padovan ẠC & Gibb K.S. (1999), ỘDetection and genetic relatedness of phytoplasma associated with plant diseases in ThailandỢ, The Journal of Biochemistry, Molecular Biology and Biophysics, 3, 133-140.
57. Seemủller E, Schneider B, Maurer R, Ahrens U, Daire X, Kison H, Lorenz K, Firrao G, Avinent L, Sears BB and Stackebrandt E (1994),
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 82 ỘPhylogenetic classification of phytopathogenic mollicutes by sequence analysis of 16S ribosomal DNAỢ, International Journal of Systematic Bacteriology, 44, 440-446.
58. Srivastava S, Singh V, Gupta PS, Sinha OK & Baitha A (2006), ỘNested PCR assay for detection of sugarcane grassy shoot phytoplasma in the leafhopper vector Deltocephalus vulgaris: a first reportỢ, Plant Pathology,
55, 25-28.
59. Singh V, Baitha A & Sinha ỌK. (2002), ỘTransmission of grassy shoot disease of sugarcane by a leafhopper (Deltocephalus vulgaris Dash and Viraktamath)Ợ, Indian Journal of Sugarcane Technology, 17, 60-63.
60. Viswanathan R, Balamuralikrishnan M, Poongothai M (2007), ỘDetection of