2.3.2.1. Phương pháp chụp ảnh hiển vi ựiện tử:
Kiểm tra sự có mặt của Phytoplasma trong mô lá cây mắa thu thập ựược bằng kắnh hiển vi ựiện tử tại Viện Vệ sinh dịch tễ TW theo phương pháp của Wongkaew and Fletcher (2004) với một số ựiều chỉnh như sau: Mẫu lá tươi từ cây bị nhiễm bệnh ựược sử dụng, cắt mẫu lá thành những mẩu nhỏ kắch thước 1- 2mm và cố ựịnh bằng 2,5% glutaraldehyde (pha trong dung dịch 0.1 M phosphate, pH 7,2) trong vòng 24 giờ ở ựiều kiện 4oC. Mẫu ựược rửa bằng dung dịch 0,1 M phosphate có chứa 0,5% sucrose và sau ựó ựược cố ựịnh bằng dung dịch 1% osmium tetroxide trong vòng 2 giờ ở ựiều kiện 4oC. Sau ựó, mẫu ựược loại nước bằng cách rửa bằng acetone với các mức nồng ựộ khác nhau bao gồm 20, 50, 70, 90, và 100%, mỗi mức nồng ựộ kéo dài 30 phút, và tiếp tục rửa bằng acetone nguyên chất trong 3 lần, mỗi lần 30 phút, và ựược gắn vào nhựa Spurr ở ựiều kiện 60oC trong 8 giờ. Ngâm mẫu trong hỗn hợp aceton-Spurr theo tỷ lệ (1:1) trong vòng 60 phút ựể tạo các lỗ hổng giúp nhựa Spurr có khả năng xâm nhập vào trong mô câỵ Mẫu cắt lát ựược nhuộm bằng chì và uranyl acetate và ựược quan sát bằng kắnh hiển vi ựiện tử JEOL 1010 (JEOL Ltd., Tokyo, Japan). 2.3.2.2. Chiết suất DNA
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28 DNA tổng số từ mô mẫu thu về ựược chiết bằng dung dịch ựệm CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide) theo phương pháp của Doyle & Doyle (1987), Wang et al. (1993) như sau:
- Ủ dung dịch hỗn hợp CTAB + β-ME (10 ộl β-ME + 1 ml CTAB) ở ựiều kiện nhiệt ựộ 65oC, trong thời gian 30 phút.
- Cho mẫu thực vật vào cối sứ sạch và cho dung dịch CTAB+ β-ME theo tỷ lệ 0,1 g/1 ml, nghiền nhuyễn hỗn hợp.
- Cho dung dịch nghiền vào ống eppendorf 1,5 ml.
- Ủ mẫu ở ựiều kiện 65oC trong 10 phút, tiến hành lắc mẫu mỗi 2-3 phút. - Ly tâm 10 phút ở ựiều kiện 15000 vòng/phút.
- Dùng pipet hút lấy phần dịch phắa trên (khoảng 400-500 ộl) và loại bỏ phần cặn phắa dướị
- Cho một thể tắch tương ựương (khoảng 500 ộl) dung dịch Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1) vào phần dung dịch phắa trên và lắc ựềụ
- Ly tâm trong 5-10 phút ở ựiều kiện 15000 vòng/phút.
- Hút lấy phần dung dịch phắa trên và loại bỏ phần dung dịch phắa dướị
- Chiết suất lần 2 với một lượng tương ựương Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), lắc ựềụ
- Ly tâm trong 10 phút ở ựiều kiện 15000 vòng/phút. - Hút lấy phần dung dịch phắa trên.
- Bổ sung một thể tắch tương ựương khoảng 400 ộl isopropanol lạnh.
- Lắc ựều, ly tâm trong 10 phút ở ựiều kiện 15000 vòng/phút (hoặc cất trong tủ lạnh -20oC trong vòng 1 giờ trước khi ly tâm.
- Loại bỏ dung dịch trên tủa, giữ lại phần kết tủạ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29 - Mở nắp eppendorf ựể trong ựiều kiện nhiệt ựộ phòng trong vòng 5-10 phút ựể mẫu khô tự nhiên.
- Cho 50 ộl H2O vô trùng hoặc TE buffer ựể hòa tan DNA trước khi cất giữ trong ựiều kiện nhiệt ựộ - 20oC.
2.3.2.3. Khuyếch ựại DNA của Phytoplasma bằng cặp mồi chung
Phản ứng PCR ựược thực hiện trong 50 ộl chứa 15 ng template DNA, 100 ng mỗi primer; 150 ộM mỗi dNTP; 4 mM MgCl2; 1 unit Dream Taq Polymerase trong môi trường 1xPCR buffer (Fermentas, Germany). Phản ứng ựược thực hiện bằng Hệ thống MyCycleTM Thermal Cycler (Eppendorf, Germany), với chu trình như sau: 5 phút khởi ựầu ở 95oC tiếp theo 35 chu kỳ với 95oC trong 30 giây, TmoC trong 1 phút, 72oC trong 2 phút và giai ựoạn kéo dài trong vòng 10 phút ở nhiệt ựộ 72oC. Trong ựó, Tm thay ựổi theo mức nhiệt ựộ từ 500C, 520C, 550C, 580C và 600C với từng cặp primer khác nhaụ Cặp oligonucleotide primer P1 (5Ỗ-AAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG GAT T-3Ỗ) và P7 (5Ỗ-CGT CCT TCA TCG GCT CTT-3Ỗ)(Deng và Hiruki, 1991; Smart et al., 1996) ựược sử dụng trong PCR trực tiếp ựể khuyếch ựại ựoạn trình tự nằm giữa 16S và 23SrRNA của Phytoplasmạ
Sau khi kết thúc phản ứng, lấy 1ộl sản phẩm PCR lần thứ nhất cho vào hỗn hợp phản ứng nested-PCR tương tự như trên nhưng với cặp oligonucleotide có ựộ dài nucleotide ngắn hơn cặp P1/P7 nhằm tăng tắnh ựặc hiệụ Phản ứng PCR cũng ựược thực hiện với ựiều kiện tương tự như PCR lần thứ nhất. Hai ựối chứng âm (negative control) bao gồm nước và DNA chiết suất từ mẫu cây mắa khỏe ựược sử dụng trong các lần PCR. điện di 10ộl từ mỗi phản ứng Nested- PCR bằng 1% (w/v) agarose gel trong dung dịch 1ừTAE, nhuộm bằng dung dịch
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30 chứa ethidium bromide (0,5 ộg/ml), và chụp ảnh DNA bằng máy GelDoc-ItTM 310 Imaging System (UK).
2.3.2.4. Chạy ựiện di trên gel agarose ựể kiểm tra sản phẩm PCR Quá trình này ựược tiến hành theo các bước như sau:
- Pha 1 lắt dung dịch ựệm ựiện di TAE 1X từ dung dịch TAE 50X ựã ựược pha sẵn từ trước: lấy 20ml TAE 50X cho vào cốc ựong, bổ sung thêm 980ml nước cất, lắc ựềụ
- Chuẩn bị bản gel: Cân 01gram agarose cho vào bình tam giác, bổ sung 100ml TAE 1X vào, cho vào lò vi sóng quay sôi ựể hòa tan agarose hoàn toàn.
- đặt lược tạo lỗ khuôn: Khi dung dịch agarose 1% nằm trong khoảng 500C thì ựổ vào khuôn dày khoảng ơ chiều dài lược. để khuôn ở nhiệt ựộ phòng ựến khi agarose ựông. Sau khoảng 30 phút thì tiến hành rút lược.
- đặt cả khay khuôn gel vào bể ựiện di, bổ sung dịch ựệm TAE 1X phủ ngập gel khoảng 1mm.
- Nhỏ mẫu vào giếng: Dùng pipet hút 10ộl sản phẩm PCR ựã nhân gen trộn với 2ộl dung dịch nhuộm màu Loađing dye rồi hút cho vào 1 giếng. Ngoài các mẫu PCR còn nhỏ thêm một giếng DNA Marker làm thước chuẩn ựể so sánh.
- Cắm nguồn ựiện cho máy ựiện di, ựạt hiệu ựiện thế 100V trong khoảng 30 phút. Sau ựó tắt máy ựiện di, ựặt bản gel lên máy phát tia UV, quan sát kết quả và chụp ảnh bằng hệ thống máy chụp ảnh Geldoc-ItTM Imaging System.
2.3.2.5. Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự gen
Tinh chiết sản phẩm PCR trên bản ựiện di agarose gel dùng QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất, các bước tiến hành bao gồm:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31 - Cắt agarose gel (khoảng 100mg) có chứa ựoạn vạch băng quan tâm cho vào ống eppendorf thể tắch 1,5ml. Cho 600 ộl dung dịch QG vào ống efpendorf chứa sản phẩm PCR và ủ ở 500C trong 10 phút ựể hòa tan agarosẹ
- Ly tâm ở ựiều kiện 12000 vòng/phút trong vòng 1 phút. Loại bỏ dung dịch phắa dưới, cho tiếp 600 ộl dung dịch QG vào ống eppendorf ựể rửa lần 2.
- Tiếp tục ly tâm ở ựiều kiện 12000 vòng/ phút trong vòng 1 phút. Loại bỏ dung dịch phắa dướị, thêm 700 ộl PE ựã bổ sung EtOH vào cột.
- Ly tâm ở ựiều kiện 12000 vòng/phút trong vòng 1 phút. Loại bỏ dung dịch phắa dướị Ly tâm lại một lần nữa ựể loại bỏ dung dịch PE còn dư, ựưa cột gắn kết sản phẩm DNA vào ống eppendorf mới có thể tắch 1,5ml.
- Thêm 50 ộl ựệm EB ựể hòa tan cặn, ổn ựịnh ở nhiệt ựộ phòng trong 1 phút. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút. Thu sản phẩm sau khi tinh chiết và bảo quản ở nhiệt ựộ -200C sau ựó gửi ựi giải trình tự gen.
2.3.2.6. Phân tắch tắnh ựa hình bằng kỹ thuật RFLP
để xác ựịnh ựược mối tương quan giữa các Phytoplasma, sản phẩm PCR ựược cắt bởi các enzyme giới hạn như AluI, MseI, RsaI, HaeIII, HpaII, EcoRI, HhaI,
HinfI, TaqI với nồng ựộ và ựiều kiện nhiệt ựộ theo khuyến cáo của nhà sản xuất (Fermentas, Vilnius, Lithuania). Sản phẩm PCR ựược ựiện di trên 2% agarose gel (100ml dung dịch agarose gel: 100ml dung dịch TAE+ 2gr agarose). Gel ựược chạy trên thiết bị ựiện di là Bio-rad Power BasicTM (Biorad, USA). Chạy ựiện di ở hiệu ựiện thế 100V trong thời gian 30 phút. Chụp ảnh bản ựiện di bằng hệ thống Geldoc-ItTM Imaging System (USA). So sánh mức ựộ tương ựồng của các isolate bệnh khác nhau thông qua việc so sánh kiểu cắt của từng enzymẹ 2.3.2.7. Giải mã gen, phân tắch trình tự và xây dựng cây phả hệ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32 Sản phẩm nested-PCR ựược tinh chiết từ agarose gel bằng DNA Purification Kit (QIAGEN, USA), và giải mã gen bằng máy ABI3100 (ABI, USA). Trình tự các mẫu ựược so sánh với Ngân hàng Gene bằng phần mềm BLAST (http://www.ncbịnlm.nih.gov/BLAST/). Cây phả hệ ựược xây dựng bằng phần mềm Clustal W version 1.83 (http://clustalw.đbj.nig.ac.jp/top-ẹhtml) và theo phương pháp Neighbor-joining của phần mềm MEGA5. So sánh mức ựộ tương ựồng trình tự gen 16SrDNA của Phytoplasma thu tại Nghệ An với các Phytoplasma ựã ựược công bố trên Ngân hàng Gen (Gene Bank).
Acholeplasma laidlawii ựược ựưa vào làm ựối chứng nằm ngoài nhóm với Phytoplasmạ Phân tắch mối quan hệ về mặt di truyền của các chủng Phytoplasmas thu ựược tại Việt Nam và các chủng Phytoplasmas trên các nước khác.
2.3.2.8. Các cặp primer sử dụng trong nghiên cứu
Nhiều cặp primer chung (universal primer), ựược tổng hợp bởi công ty Invitrogen, USA, ựã ựược sử dụng trong nghiên cứu nhằm phát hiện và ựịnh loại Phytoplasma gây bệnh thực vật (Deng và Hiruki, 1991; Smart et al., 1996), (Bảng 2.1).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33
Bảng 2.1. Các cặp primer ựược sử dụng trong nghiên cứụ
Primer Trình tự gen (theo chiều 5Ỗ-3Ỗ) Vùng khuyếch ựại
(A)
P1 AAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG GAT T 16S (A)
P7 CGT CCT TCA TCG GCT CTT 23S
(B)
R16mF2 CAT GCA AGT CGA ACG A 16S
(B)
R16mR1 CTT AAC CCC AAT CAT CGA C 16S
(B)
R16F2n GAA ACG AGT GCT AAG ACT GG 16S
(B)
R16R2 TGA CGG GCG GTG TGT ACA CCC G 16S
(B)
R16F2 ACG ACT GCT GCT AAG ACT GG 16S
(B)
R16F0 CTG GCT CAG GAT TAA CGC TGG CGG C 16S (B)
R16R0 GGA TAC CTT GTT ACG ACT TAA CCC C 16S (B)
R16F2N GAA ACG GCG GTG TGT ACA AAC CCC G 16S (B)
R16(I)R2 AAG AGT GGA AAA ACT CCC 16S
(B)
R16(I)R1 CAA TCC GAA CTG AGA CTG T 16S
(B)
R16(III)F2 AAG AGT GGA AAA ACT CCC 16S
(B)
R16(III)R1 TCC GAA CTG AGA TTG A 16S
(B)
R16(V)F1 TTA AAA GAC CTT CTT CGG 16S
(B)
R16(V)R1 TTC AAT CCG TAC TGA GAC TAC C 16S
Ghi chú: (A) Primer sử dụng trong PCR cho chu trình ựầu tiên. (B) Primer sử dụng trong nested-PCR cho chu trình thứ nhất và thứ 2.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34 16S rRNA gene IS 23S P1 P7 Fa Rb (~1784 bp) (~1248 bp)
Hình 2.1. Vị trắ của một số primer trên ựoạn gen 16-23SrRNẠ
Cặp primer chung (universal primer) P1/P7 ựược thiết kế dựa trên ựoạn bảo thủ của gen 16SrRNA và 23SrRNA từ nhiều chủng Phytoplasma gây bệnh khác nhaụ IS=intergenic spacer; 23S = 23SrRNA gen. (Guo et al., 2000; Heinrich et al., 2001).
Trong ựó, cặp P1/P7 ựược sử dụng trong phản ứng PCR lần thứ nhất khuyếch ựại ựoạn 16-23SrRNA, các cặp primer còn lại ựược thiết kế nằm phắa trong P1 và P7, ựược sử dùng trong lần PCR thứ 2 (nested PCR).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN