chồi cỏ bằng phương pháp PCR
3.2.2.1. Kết quả xác ựịnh Phytoplasma trong mô mắa bệnh bằng phương pháp PCR trực tiếp
để xây dựng quy trình chẩn ựoán và giám ựịnh Phytoplasma gây bệnh chồi cỏ mắa trong ựiều kiện Việt Nam, chúng tôi ựã sử dụng nhiều cặp primer ở
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 45 các vị trắ khác nhau trong ựoạn gen 16-23SrRNA của Phytoplasma với những chu kỳ của phản ứng PCR khác nhau (Hình 2.1, Bảng 2.1).
Cặp primer chung P1/P7 ựã ựược dùng ựể phát hiện Phytoplasma gây bệnh trên nhiều loài cây trồng và cỏ dại (Deng and Hiruki, 1991; Smart et al., 1996). để xác ựịnh cặp primer P1/P7 có khả năng phát hiện ựược Phytoplasma gây bệnh chồi cỏ mắa tại Việt nam hay không, chúng tôi ựã sử dụng cặp primer này trong phản ứng PCR trực tiếp. Phản ứng ựã ựược thực hiện trong ựiều kiện nhiệt ựộ gắn primer (T m
0
C) ở các mức 50, 52, 55, 58, 600C.
Tại ựiều kiện nhiệt ựộ 500C, sử dụng cặp primer P1/P7 không phát hiện ựược Phytoplasma gây hại trên mắa ở các ựiểm ựiều tra; trong khi ựó mẫu bệnh ựối chứng dương vẫn cho kết quả tốt với ựộ dài khoảng 1200bp và mẫu ựối chứng cây mắa khỏe (H) không biểu hiện bệnh. Kết quả thắ nghiệm tại các ựiều kiện nhiệt ựộ 52, 55, 58, 600C cũng tương tự như trên (Hình 3.8; Hình 3.9; Hình 3.10; Hình 3.11; Hình 3.12).
Hình 3.8. Kết quả sản phẩm PCR ở ựiều kiện nhiệt ựộ 500C.
M: 1kb DNA marker; P: đối chứng dương; H: Mẫu mắa khỏe thu tại Hà Nội; 1->7: Mẫu cây mắa biểu hiện triệu chứng bệnh.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 46
Hình 3.9. Kết quả sản phẩm PCR ở ựiều kiện nhiệt ựộ 520C.
M: 1kb DNA marker; P: đối chứng dương; H: Mẫu mắa khỏe thu tại Hà Nộị 1->7: Mẫu cây mắa biểu hiện triệu chứng bệnh.
Hình 3.10. Kết quả sản phẩm PCR ở ựiều kiện nhiệt ựộ 550C.
M: 1kb DNA marker; P: đối chứng dương; H: Mẫu mắa khỏe thu tại Hà Nộị 1->7: Mẫu cây mắa biểu hiện triệu chứng bệnh.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 47
Hình 3.11. Kết quả sản phẩm PCR ở ựiều kiện nhiệt ựộ 580C.
M: 1kb DNA marker; P: đối chứng dương; H: Mẫu mắa khỏe thu tại Hà Nộị 1->7: Mẫu cây mắa biểu hiện triệu chứng bệnh.
Hình 3.12. Kết quả sản phẩm PCR ở ựiều kiện nhiệt ựộ 600C.
M: 1kb DNA marker; P: đối chứng dương; H: Mẫu mắa khỏe thu tại Hà Nộị 1->7: Mẫu cây mắa biểu hiện triệu chứng bệnh.
Như vậy, khi sử dụng cặp primer P1/P7 tại các ựiều kiện nhiệt ựộ khác nhau từ 50, 52, 55, 58, 600C ựã không phát hiện ựược Phytoplasma trên các mẫu bệnh có triệu chứng ựã thu thập tại Nghệ An và Bình Dương. Trong khi ựó, mẫu bệnh ựối chứng dương vẫn xuất hiện vạch trên bản gel ựiện di ở ựộ dài mong
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 48 muốn khoảng 1200bp và mẫu ựối chứng cây khỏe cho kết quả âm tắnh. Cặp primer P1/P7 sử dụng trong phản ứng PCR trực tiếp ựã không phát hiện ựược Phytoplasma trong mẫu cây mắa bị bệnh chồi cỏ.
3.2.2.2. Kết quả xác ựịnh Phytoplasma trong mô mắa bệnh bằng phương pháp nested-PCR
Cặp primer P1/P7 và R16mF2/R16mR1
Các cặp primer P1/P7 và R16mF2/R16mR1, có thể sử dụng ựể phát hiện Phytoplasma trên một số cây trồng, tuy nhiên sử dụng cặp mồi này trong phản ứng nested- PCR với các mẫu mắa bị bệnh chồi cỏ ựã không phát hiện ựược Phytoplasma ở các ựiều kiện nhiệt ựộ gắn primer ở các mức 50, 52, 55, 58 và 60oC (Hình 3.13).
Hình 3.13. Nested-PCR sử dụng cặp primer P1/P7 và R16mF2/R16mR1 ựể phát hiện Phytoplasma trong mô cây mắạ
M. 1kb DNA marker; H: cây mắa khỏe thu tại Hà Nội; 1-4: Mẫu cây mắa biểu hiện triệu chứng chồi cỏ thu tại Nghệ An. Phản ứng PCR ựược thực hiện với 2 cặp primer là P1/P7 và R16mF2/R16mR1 tại các ựiều kiện nhiệt ựộ gắn primer khác nhau như 50, 52, 55, 58 và 60oC.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 49
Cặp primer P1/P7 và R16F2/R16R2
Cặp primer P1/P7 và R16F2/R16R2, tuy ựã tạo ra một số sản phẩm PCR nhưng phần lớn là những sản phẩm không ựặc hiệụ Ngoại trừ mẫu số 3 cho 1 sản phẩm có kắch thước mong muốn nhưng lại kèm theo sản phẩm phụ với kắch thước lớn hơn nhiều so với sản phẩm chắnh (Hình 3.14).
Hình 3.14. Nested- PCR sử dụng cặp primer P1/P7 và R16F2/R16R2 ựể phát hiện Phytoplasma trong mô cây mắạ
M. 1kb DNA marker; H: cây mắa khỏe thu tại Hà Nội; 1-4: Mẫu cây mắa biểu hiện triệu chứng chồi cỏ thu tại Nghệ An. Phản ứng PCR ựược thực hiện với 2 cặp primer là P1/P7 và R16F2/R16R2 tại các ựiều kiện nhiệt ựộ gắn primer khác nhau như 50, 52, 55, 58 và 60oC.
Các cặp primer P1/P7- R16F0/R16R0 và P1/P7- R16F2N/R16R2
Các cặp primer: R16F0/R16R0, R16F2N/R16R2 cũng không khuyếch ựại ựược bất kỳ sản phẩm nào tại tất cả các ựiều kiện gắn primer thử nghiệm (Hình 3.15, 3.16).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 50
Hình 3.15. Nested -PCR sử dụng cặp primer P1/P7 và R16F0/R16R0 ựể phát hiện Phytoplasma trong mô cây mắạ
M: 1kb DNA marker; H: cây mắa khỏe thu tại Hà Nội; 1-4: Mẫu cây mắa biểu hiện triệu chứng chồi cỏ thu tại Nghệ An. Phản ứng PCR ựược thực hiện với 2 cặp primer là P1/P7 và R16F0/R16R0 tại các ựiều kiện nhiệt ựộ gắn primer khác nhau như 50, 52, 55, 58 và 60oC.
Hình 3.16. Nested-PCR sử dụng cặp primer P1/P7 và R16F2N/R16R2 ựể phát hiện Phytoplasma trong mô cây mắạ
M: 1kb DNA marker; H: cây mắa khỏe thu tại Hà Nội; 1-4: Mẫu cây mắa biểu hiện triệu chứng chồi cỏ thu tại Nghệ An. Phản ứng PCR ựược thực hiện với 2 cặp primer là P1/P7 và R16F2N/R16R2 tại các ựiều kiện nhiệt ựộ gắn primer khác nhau như 50, 52, 55, 58 và 60oC.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 51 Ba cặp primer ựặc hiệu cho ba nhóm Phytopalsma khác nhau là nhóm Phytoplasma 16SrI: R16(I)F2/R16(I)R1}, nhóm Phytoplasma 16SrIII là cặp primer R16(III)F2/R16(III)R1 và nhóm Phytoplasma 16SrV với cặp primer {R16(V)F2/R16(V)R1} khi sử dụng với cặp primer P1/P7 trong phản ứng nested-PCR cũng ựều không cho sản phẩm mong muốn ở tất cả các ựiều kiện nhiệt ựộ gắn primer (Hình 3.17; 3.18; 3.19).
Hình 3.17. Nested -PCR sử dụng cặp primer P1/P7 và R16(I)F2/R16(I)R1 ựể phát hiện Phytopalsma trong mô cây mắạ
M: 1kb DNA marker; H: cây mắa khỏe thu tại Hà Nội; 1-4: Mẫu cây mắa biểu hiện triệu chứng chồi cỏ thu tại Nghệ An. Phản ứng PCR ựược thực hiện với 2 cặp primer là P1/P7 và R16(I)F2/R16(I)R1 tại các ựiều kiện nhiệt ựộ gắn primer khác nhau như 50, 52, 55, 58 và 60oC.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 52
Hình 3.18. Nested PCR sử dụng cặp primer P1/P7 và R16(III)F2/R16(III)R1 ựể phát hiện Phytoplasma trong mô cây mắạ
M: 1kb DNA marker; H: cây mắa khỏe thu tại Hà Nội; 1-4: Mẫu cây mắa biểu hiện triệu chứng chồi cỏ thu tại Nghệ An. Phản ứng PCR ựược thực hiện với 2 cặp primer là P1/P7 và R16(III)F2/R16(III)R1 tại các ựiều kiện nhiệt ựộ gắn primer khác nhau như 50, 52, 55, 58 và 60oC.
Hình 3.19. Nested -PCR sử dụng cặp primer P1/P7 và R16(V)F2/R16(V)R1 ựể phát hiện Phytoplasma trong mô cây mắạ
M: 1kb DNA marker; H: cây mắa khỏe thu tại Hà Nội; 1-4: Mẫu cây mắa biểu hiện triệu chứng chồi cỏ thu tại Nghệ An. Phản ứng PCR ựược thực hiện với 2 cặp primer là P1/P7 và R16(V)F2/R16(V)R1 tại các ựiều kiện nhiệt ựộ gắn primer khác nhau 50, 52, 55, 58 và 60oC.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 53
Cặp primer P1/P7 và R16F2n/R16R2
Khi sử dụng cặp primer P1/P7 và R16F2n/R16R2 trong phản ứng nested- PCR ựể phát hiện Phytoplasma tại các ngưỡng nhiệt ựộ gắn primer ựã xác ựịnh ựược kết quả rất tốt tại ựiều kiện nhiệt ựộ gắn primer là 55oC. Kết quả phản ứng PCR chỉ cho 1 sản phẩm với kắch thước khoảng 1200 bp (Hình 3.20). Nested PCR sử dụng 2 cặp primer P1/P7 và R16F2n/R16R2, với ựiều kiện như sau: 5 phút khởi ựầu ở 95oC tiếp theo 35 chu kỳ với 95oC trong 30 giây, 55oC trong 1 phút, 72oC trong 2 phút và giai ựoạn kéo dài trong vòng 10 phút ở nhiệt ựộ 72oC.
Hình 3.20. Nested-PCR sử dụng cặp primer P1/P7-R16F2n/R16R2 ựã khuyếch ựại ựoạn gen 16SrRNA của Phytoplasma trong mô cây mắa biểu hiện triệu chứng chồi cỏ mắạ
Ký hiệu H: cây khoẻ; M: 1 kb DNA marker; Các mẫu từ 1- 8: mẫu mắa có thể hiện triệu chứng bệnh chồi cỏ mắa thu tại Nghệ An. Mũi tên chỉ sản phẩm PCR với kắch thước khoảng 1200bp.
3.2.2.3. Kết quả giám ựịnh bệnh chồi cỏ mắa tại đại học Nottingham -Vương quốc Anh
Các mẫu mắa bị bệnh chồi cỏ ựã ựược gửi ựến phòng nghiên cứu bệnh Phytoplasma của đại học Nottingham, Vương quốc Anh ựể xác ựịnh theo
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 54 phương pháp nested-PCR với các cặp primer P1/P7 và R16F2n/R16R2 . Kết quả giám ựịnh cho thấy không có nhiều sự sai khác về trình tự ựoạn gen 16SrRNA ựã nhận ựược tại phòng thắ nghiệm của trường đại học Nottingham, Vương quốc Anh so với kết quả thu ựược của Viện Bảo vệ thực vật. (Hình 3.21).
R16F2n/R16R2
Hình 3.21. Sản phẩm PCR ựược thực hiện tại phòng thắ nghiệm của đại học Nottingham, Vương quốc Anh.
M: DNA marker; 1: không có DNA; 2: Không có enzyme; 3: Không có primers; 4-6: mẫu mắa thu ựược tại Nghệ An; 7: đối chứng dương. Sản phẩm PCR lần thứ nhất với cặp primers P1/P7 ựược sử dụng làm DNA khuôn cho PCR lần thứ haị
Kết quả chạy PCR và nested PCR khi sử dụng các cặp primer tại các ngưỡng nhiệt ựộ gắn primer 50, 52, 55, 58, 600C cho kết quả ựược tổng hợp ở bảng 3.3. Trong ựó chỉ có cặp primer P1/P7 và R16F2n/R16R2 khi gắn mồi tại ựiều kiện nhiệt ựộ 550C cho kết quả tốt nhất. Kết quả ựối với tất cả các cặp primer còn lại ựều âm tắnh so với ựối chứng dương.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 55
Bảng 3.3. Kết quả chạy PRC các cặp primer
TT Cặp primer sử dụng Kết quả 1 P1/P7 (-) 2 P1/P7 và R16mF2/R16mR1 (-) 3 P1/P7 và R16F2/R16R2 (-) 4 P1/P7 và R16F0/R16R0 (-) 5 P1/P7 và R16F2N/R16R2 (-) 6 P1/P7 và R16(I)F2/R16(I)R1 (-) 7 P1/P7 và R16(III)F2/R16(III)R1 (-) 8 P1/P7 và R16(V)F2/R16(V)R1 (-) 9 P1/P7 và R16F2n/R16R2 (+)
3.2.2.4. Phân tắch tắnh ựa hình RFLP sử dụng Enzyme giới hạn
Sản phẩm PCR ựược sử dụng ựể phân tắch sự ựa hình của Phytoplasma gây bệnh chồi cỏ mắa là sản phẩm ựược khuyếch ựại từ DNA chiết suất từ 40 mẫu cây mắa có biểu hiện triệu chứng chồi cỏ thu tại Nghệ An với kắch thước khoảng 1,2-kb.
Sản phẩm PCR ựược cắt bởi một số enzyme giới hạn như RsaI, HaeIII,
AluI, HpaII và MseỊ đối với tất cả các mẫu trừ mẫu số 7, enzyme RsaI ựã cắt sản phẩm PCR và cho ra 2 sản phẩm chắnh với kắch thước 500 bp và 700 bp.
HaeIII cắt các sản phẩm PCR thành 2 sản phẩm với kắch thước khoảng 1100 bp và 100 bp. AluI cắt các sản phẩm PCR thành 3 sản phẩm khoảng 750, 170 và 100 bp. Có 2 sản phẩm kắch thước khoảng 850 bp và 350 bp. Chỉ phát hiện ựược 2 sản phẩm chắnh với kắch thước 350 bp và 250 bp khi cắt sản phẩm PCR với MseI (hình 3.22).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 56
Hpa II Mse I
1 2 3 4 5 6 7 8
M M 1 2 3 4 5 6 7 87
Hình 3.22. Phân tắch tắnh ựa hình sản phẩm nested-PCR bằng enzyme giới hạn.
Sản phẩm nested-PCR ựược cắt bởi một số enzyme giới hạn: RsaI, HaeIII, AluI, HpaII và MseỊ M: 100bp DNA marker; 1-8: Mẫu mắa biểu hiện triệu chứng chồi cỏ mắa thu tại Nghệ An.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 57
3.2.2.5. Giải mã và phân tắch trình tự gen
Cắt ựoạn gel có kắch thước khoảng 1,2kb từ kết quả chạy nested-PCR sử dụng cặp primer P1/P7-R16F2n/R16R2 ựể tinh sạch lấy DNA, sản phẩm sau khi tinh sạch ựược gửi ựi ựọc trình tự gene tại Hàn Quốc. Tất cả các sản phẩm ựều ựọc không bị nhiễu và có chiều dài khoảng 1198 nucleotide (Hình 3.23).
ORIGIN
1 ggcatctttt tatttttaaa gacctttttc ggaaggtatg cttaaagagg ggcttgcgtc 61 acattagtta gttggcaggg taaaggccta ccaagactat gatgtgtagc tggacttgag 121 aggttgaaca gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta 181 gggaattttc ggcaatggag gaaactctga ccgagcaacg ccgcgtgaac gatgaagtat 241 ttcggtatgt aaagttcttt tattgaagaa gaaaaaatag tggaaaaact atcttgacga 301 tattcaatga ataagccccg gcaaactatg tgccagcagc cgcggtaata catagggggc 361 gagcgttatt ccggaattat tgggcgtaaa gggtgcgtag gcggtttaat aagtctatag 421 tttaatttca gtgcttaaca ctgtcctgct atagaaacta ttagactaga gtgagataga 481 ggcaagtgga attccatgtg tagcggtaaa atgcgtaaat atatggagga acaccagagg 541 cgtaggcggc ttgctgggtc tttactgacg cctgaggcac gaaagcgtgg ggagcaaaca 601 ggattagata ccctggtagt cccacgccgt aaacgatgag tactaagtgt cgggattact 661 cggtactgaa gttaacacat taagtactcc gcctgagtta gtacgtacgc aagtatgaaa 721 cttaaaggaa ttgacgggac tccgcacaag cggtggatca tgttgtttaa ttcgaagata 781 cacgaaaaac cttaccaggt cttgacatac tctgcaaagc tatagcaata tagtggaggt 841 tatcagggat acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttaggttaa 901 gtcctaaaac gagcgcaacc cttgtcatta gttgccagca tgtcatgatg ggcactttaa 961 tgagactgcc aatgaaaaat ggaggaaggt gaggatcacg tcaaatcatc atgcccctta 1021 tgatctgggc tacaaacgtg atacaatggc tgttacaaag gagtagctga aaacggcaag 1081 tttttataac caaatctcaa taaaaaccgt ctcaagttcg ggatggaaag tcggcaaact 1141 ggacttccaa ggaaagtggg aatcgctaag gaaatcggga aaccaccatt cgcgggaạ
Hình 3.23. Trình tự ựoạn gen 16SrRNA của Phytoplasma gây bệnh chồi cỏ mắa tại Nghệ An (mã GenBank: JF928001).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 58
Bảng 3.4. Mức sai khác trình tự nucleotide của SCGSNA so với các ựại diện của các nhóm Phytoplasma khác nhaụ
Phytoplasma Nguồn gốc Mã số GenBank độ tương ựồng (%) Số nucl. sai khác Chiều dài ựoạn gen (bp) Sugarcane grassy shoot India AM261831 99 7 1222
Rice yellow dwarf Japan AB052873 96 17 1360
Napier grassy stunt Kenya AY736374 96 13 1247
Brachiaria grass white leaf Japan AB052872 96 15 1520 Coconut yellow decline Malaysia EU636906 96 15 1247 Bermuda grass white leaf Italia EF444485 95 29 1489
Ghi chú: nucl.: Nucleotidẹ
đại diện một số nhóm Phytoplasma khác nhau có ựộ tương ựồng cao (trên 95%) ựược so sánh với Phytoplasma gây bệnh chồi cỏ mắa tại Nghệ an dựa vào sự sai khác trình tự nucleotidẹ Kết quả cho thấy, bệnh chồi cỏ mắa tại Nghệ an có ựộ tương ựồng cao nhất (99%) với bệnh chồi cỏ mắa tại Ấn ựộ (có mã số genbank: AM261831) và trình tự nucleotide sai khác là 7 (Bảng 3.4).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 59 SCGS-VN ---GGCATCTTTTTATTTTTAAAG-ACC 24 SCGS-India GGAAACAGTTGCTAAGACTGGATAGGAAATAAAAAGGCATCTTTTTATTTTTAAAAGACC 60 ********************. *** SCGS-VN TTTTTCGGAAGGTATGCTTAAAGAGGGGCTTGCGTCACATTAGTTAGTTGGCAGGGTAAA 84 SCGS-India TTTTTCGGAAGGTATGCTTAAAGAGGGGCTTGCGTCACATTAGTTAGTTGGCAGGGTAAA 120 ************************************************************ SCGS-VN GGCCTACCAAGACTATGATGTGTAGCTGGACTTGAGAGGTTGAACAGCCACATTGGGACT 144 SCGS-India GGCCTACCAAGACTATGATGTGTAGCTGGACT-GAGAGGTTGAACAGCCACATTGGGACT 179 ******************************** *************************** SCGS-VN GAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAA 204 SCGS-India GAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAA 239 ************************************************************ SCGS-VN CTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTATGTAAAGTTCTTTTATT 264 SCGS-India CTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTATGTAAAGTTCTTTTATT 299 ************************************************************ SCGS-VN GAAGAAGAAAAAATAGTGGAAAAACTATCTTGACGATATTCAATGAATAAGCCCCGGCAA 324 SCGS-India GAAGAAGAAAAAATAGTGGAAAAACTATCTTGACGATATTCAATGAATAAGCCCCGGCAA 359 ************************************************************ SCGS-VN ACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCGAGCGTTATTCCGGAATTATTGGG 384 SCGS-India ACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCGAGCGTTAT-CCGGAATTATTGGG 418 ********************************************* ************** SCGS-VN CGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTTTAATAAGTCTATAGTTTAATTTCAGTGCTTAACACTGT 444 SCGS-India CGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTTTAATAAGTCTATAGTTTAATTTCAGTGCTTAACACTGT 478 ************************************************************ SCGS-VN CCTGCTATAGAAACTATTAGACTAGAGTGAGATAGAGGCAAGTGGAATTCCATGTGTAGC 504 SCGS-India CCTGCTATAGAAACTATTAGACTAGAGTGAGATAGAGGCAAGTGGAATTCCATGTGTAGC 538 ************************************************************ SCGS-VN GGTAAAATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGAGGCGTAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTA 564 SCGS-India GGTAAAATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGAGGCGTAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTA 598 ************************************************************ SCGS-VN CTGACGCCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCCA 624 SCGS-India CTGACG-CTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGT-CCA 656 ****** ************************************************* *** SCGS-VN CGCCGTAAACGATGAGTACTAAGTGTCGGGATTACTCGGTACTGAAGTTAACACATTAAG 684 SCGS-India CGCCGTAAACGATGAGTACTAAGTGTCGGGATTACTCGGTACTGAAGTTAACACATTAAG 716 ************************************************************ SCGS-VN TACTCCGCCTGAGTTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCG 744 SCGS-India TACTCCGCCTGAG-TAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCG 775
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 60 ************* ********************************************** SCGS-VN CACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGATACACGAAAAACCTTACCAGGTCTTG 804 SCGS-India CACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGATACACGAAAAACCTTACCAGGTCTTG 835 ************************************************************ SCGS-VN ACATACTCTGCAAAGCTATAGCAATATAGTGGAGGTTATCAGGGATACAGGTGGTGCATG 864 SCGS-India ACATACTCTGCAAAGCTATAGCAATATAGTGGAGGTTATCAGGGATACAGGTGGTGCATG 895 ************************************************************ SCGS-VN GTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTAGGTTAAGTCCTAAAACGAGCGCAACCCTTG 924 SCGS-India GTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTAGGTTAAGTCCTAAAACGAGCGCAACCCTTG 955 ************************************************************ SCGS-VN TCATTAGTTGCCAGCATGTCATGATGGGCACTTTAATGAGACTGCCAATGAAAAAT-GGA 983