Phương pháp ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) ựã ựược thử nghiệm ựể phát hiện Phytoplasma gây bệnh chồi cỏ từ mô cây mắa bị bệnh (Viswanathan., 1997). Tuy nhiên, phương pháp này có ựộ nhạy không cao và không chắnh xác do kháng huyết thanh ựã tạo ra những phản ứng không ựặc hiệu với cả dịch cây khỏẹ Việc sử dụng một số ựoạn dò DNA (DNA probe) trong thập niên 80 và 90 ựã phát hiện một số phần DNA ựặc hiệu trong bộ gennome của một số chủng Phytoplasma (Harrison et al., 1994). Phương pháp Southern hybridization và phân tắch RFLP sử dụng ựoạn dò DNA ựã có thể phân biệt ựược 3 loài phụ, thuộc về nhóm Ộaster yellows phytoplasmaỢ và 7 loài phụ trong nhóm ỘX-diseaseỢ (Lee et al., 1992). Tuy nhiên, phương pháp sử dụng ựoạn dò DNA là quá trình bao gồm nhiều khâu phức tạp, người thực hiện phải có trình ựộ và tay nghề caọ
để xây dựng bộ primer chung sử dụng trong phản ứng PCR khuyếch ựại gen 16SrDNA của Phytoplasma, hoặc xây dựng phương pháp real-time PCR, trình tự toàn bộ của gen 16SrDNA, ựoạn nằm giữa 16S/23SrDNA và một phần 23SrRNA ựã ựược ựọc, (Namba et al., 1993a, 1993b; Hodgetts et al., 2008,2009). Từ ựó, phương pháp sử dụng primer chung ựặc hiệu của Phytoplasma hoặc primer ựặc hiệu cho từng nhóm Phytoplasma ựược thiết kế dựa trên ựoạn bảo thủ của gen 16SrRNA và 23SrRNA (Lee et al., 1993, 1994).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 18 PCR và một số kỹ thuật khuyếch ựại DNA khác là sự lựa chọn tốt nhất ựể chẩn ựoán Phytoplasmạ Các phương pháp này có một số ưu ựiểm so với các phương pháp khác do linh hoạt, tương ựối ựơn giản, ựộ nhạy và tắnh ựặc hiệu caọ đặc biệt, ựộ nhạy có thể ựược gia tăng khi thực hiện phản ứng PCR 2 lần (nested PCR), một lượng nhỏ sản phẩm PCR lần thứ nhất ựược ựưa vào dung dịch phản ứng của phản ứng PCR lần thứ 2, mà cặp primer sử dụng là cặp primer nằm phắa bên trong của cặp primer sử dụng trong phản ứng PCR lần thứ 1. Từ ựó có thể tách biệt, xác ựịnh và phân loại Phytoplasma dựa trên cây phát sinh loài từ trình tự ựoạn gen rRNA thu ựược bằng kỹ thuật PCR (Lee et al., 1998, 2000). Phương pháp nested PCR ựã phát hiện ựược một số loài và nhóm phụ, trong số ựó có nhóm rice yellow dwarf (RYD) Phytoplasma hay còn gọi là nhóm 16SrXI bao gồm Phytoplasma gây bệnh chồi cỏ mắa (SCGS) và bệnh trắng lá mắa (SCWL) cùng với một số chủng Phytoplasma khác gây bệnh chủ yếu trên cây thuộc họ hòa thảo và trắng lá cỏ gà (BGWL) (Hanboonsong et al., 2002).
Dựa trên sự phân tắch cây phát sinh loài sử dụng trình tự gen 16SrRNA hoặc 16SrRNA và gen ribosomal protein, ựã xác ựịnh ựược vị trắ của ựối tượng gây bệnh mới Phytoplasma (Seemủller et al., 1994). Nhiều nhà khoa học ựã nỗ lực xác ựịnh và phân loại chủng Phytoplasma lạ dựa trên phương pháp phân tắch trình tự gen 16SrDNA hoặc ựoạn trình tự nằm giữa 16SrDNA và 23SrRNA (Kirkpatrick et al, 1994).
Một số nhà khoa học cũng ựã sử dụng các enzyme giới hạn ựể phân tắch tắnh ựa hình của ựoạn trình tự 16SrDNA từ sản phẩm PCR thu ựược (Schneider et al., 1993). đây là phương pháp ựơn giản, hiệu quả và dễ thực hiện. Việc phân loại nhóm Phytoplasma dựa trên việc phân tắch RFLP sử dụng enzyme giới hạn ựã mang tắnh ựồng nhất so với việc phân nhóm phát sinh loài dựa trên số liệu về
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19 trình tự gen phân tắch (Gundersen et al., 1994). Dựa trên việc phân tắch RFLP sử dụng trình tự ựoạn gen 16SrDNA của Phytoplasma, Lee và cộng sự ựã xác ựịnh 10 nhóm Phytoplasma chắnh và 15 nhóm phụ (Lee et al., 1993). Về sau phương pháp này ựược phát triển, mở rộng và ựã xác ựịnh ựược 14 nhóm và 38 nhóm phụ (Lee et al., 1998). Sau ựó, một số nhà nghiên cứu ựã tách biệt rõ hơn các nhóm phụ trong mỗi nhóm chắnh dựa trên những ựoạn trình tự ắt bảo thủ hơn như sử dụng khối gen ribosomal protein hoặc ựoạn trình tự nằm giữa gen 16S và 23SrRNA, từ ựó ựã xác ựịnh ựược một số nhóm phụ khác (Gundersen et al., 1994, 1996). Những nhóm phụ ựược xác ựịnh bằng phương pháp này ựã ựồng nhất với những khối genome phụ ựược xác ựịnh từ trước dựa trên những nghiên cứu về tắnh tương ựồng trình tự DNA sử dụng phép lai phân tử (Lee et al., 1994). Tuy nhiên phương pháp này cũng không thể phân biệt sâu hơn trong từng nhóm phụ do sự biến ựộng của các marker có mặt trên gen 16SrRNA còn ở mức ựộ hạn chế (Martini et al., 2007). Vắ dụ, Phytoplasma gây bệnh chồi cỏ mắa và Phytoplasma gây bệnh trắng lá mắa có sự tương ựồng về mặt di truyền tới 99% và thường gây ra những triệu chứng khá giống nhau khó có thể phân biệt. Một số cuộc khảo sát cho thấy, ựoạn 5Ỗ-end của gen 16SrRNA có chứa nhiều thông tin quan trọng phục vụ cho việc phân biệt SCWLD và SCGSD (Sdoodee et al., 1999; Marcone, 2002).
đối với vi khuẩn, gen ribosomal protein (rp) là những gen có cùng nguồn gốc phát sinh và mang những dấu hiệu phát sinh loài rất caọ Sự phát sinh loài dựa vào trình tự gen rp ựã làm rõ hơn về mối tương quan phát sinh loài trong số các chủng Phytoplasma (Martini et al., 2007). Việc sử dụng một gen khác, gen secA
ựể tăng cường khả năng phân biệt sự phát sinh loàị Với khả năng biến ựổi cao hơn so với gen 16SrRNA, gen rp và secA cung cấp nhiều marker hữu ắch hơn ựể
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20 tách biệt những chủng sinh thái trước ựây chưa thể phân biệt ựược khi áp dụng gen 16SrRNA (Hodgetts et al., 2008).
Gần ựây phương pháp Ộloop-mediated isothermal amplificationỢ (LAMP) ựã ựược phát triển ựể giám ựịnh bệnh do Phtytoplasmạ Phương pháp này nhanh hơn phương pháp PCR và không cần nhiều bước thực hiện như phương pháp nested PCR, do ựó sẽ giảm khả năng bị nhiễm tạp của mẫu phân tắch. LAMP là phương pháp nhân bản DNA nhanh, ựược phát triển bởi Notomi (Notomi et al,. 2000). Kỹ thuật này ựược ứng dụng ựể phát hiện virus, vi khuẩn, Phytoplasma, nấm và ký sinh gây bệnh trên cả cây trồng và vật nuôị Phương pháp này yêu cầu một bộ mồi ựặc biệt ựể nhận ra từ 2-6 vùng trên gen ựắch, do vậy làm tăng ựộ nhạy và ựộ nhanh của phản ứng. Kết quả của phản ứng LAMP có thể ựược quan sát bằng mắt thường hay bằng ựiện di trên gel agarose, hoặc thêm thuốc nhuộm phát quang dưới tia cực tắm. Kỹ thuật LAMP ựược thực hiện trong ựiều kiện ựẳng nhiệt. Vì vậy, cần sử dụng các thiết bị giữ nhiệt như bể ổn nhiệt, tủ ấm. Kỹ thuật LAMP có thể kết hợp với kỹ thuật tách chiết DNA tổng số theo một cách mới, quy trình có thể ựược thực hiện trong một giờ (Sugawa et al., 2012).
Dickinson ựã thiết kế primer ựể giám ựịnh nhóm Phytoplasma thuộc nhóm 16SrXI và XIV bao gồm cả SCGSD và SCWLD và các phương pháp này ựã ựược kết hợp thành hệ thống phát hiện nhanh những chủng Phytoplasma này (Dickinson, công trình chưa công bố).