* STZ (streptozotocin) Sigma, ST.Louse.
* Ethanol 900, hóa chất dùng cho quá trình tách chiết, định tính, định lượng như n-hexan, ethylacetate…
* Máy đo đường huyết tự động One Touch Ultra.
* Bộ kít thử Medisense optium blood glucose electrodes.
* Cân phân tích, máy ly tâm, lò vi sóng, máy lắc vontex, pipetman… Các thiết bị đều đảm bảo tiêu chuẩn về độ chính xác và an toàn.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết mẫu nghiên cứu.
Từ 3000g Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.) rửa sạch, sấy khô được ngâm chiết với ethanol 90%. Quá trình ngâm chiết được tiến hành lặp lại 3 lần. Phần nước lọc được lọc qua giấy lọc 3 lần để loại bỏ cặn thu được dịch chiết. sau đó dùng đèn 200W sấy làm bay hơi nước để thu lấy cao cồn , sau đó
30
mẫu lại tiếp tục đươc ngâm với n-hexan tiến hành tương tự thu được cao n- hexan, tiếp tục ngâm với ethylacetate thu được cao ethylacetate
2.2.2. Phƣơng pháp khảo sát thành phần hóa học của cây Vú sữa đất
(Euphorbia hirta L.)
2.2.2.1. Định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên
Cao các phân đoạn được hòa tan trong dung môi thích hợp với từng loại phản ứng định tính. Các nhóm phản ứng được trình bày tóm tắt trong bảng sau:
Bảng 2.1. Bảng các phản ứng định tính đặc trƣng
Nhóm hợp
chất Phản ứng Thuốc thử Dấu hiệu nhận biết
Flavonoid
Shinoda Mg/HCL
Màu đỏ, hồng, da cam xuất hiện chứng tỏ sự có mặt của flavon, flavonol và các dẫn xuất hydro của chúng.
Diazo hóa Diazo Phản ứng cho màu da cam là dương tính.
Dung dịch
kiềm NaOH10%
Phản ứng có kết quả dương tính khi xuất hiện màu vàng cam.
Acid sulfuric H2SO410%
Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của favon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron.
Vanilin/HCL Màu đỏ son xuất hiện chứng tỏ sự có mặt của catechin.
31
hiện màu đỏ đậm. Dung dịch 5%, Gelatin/1%
NaCL
Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết tủa. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Acetate chì 10% Phản ứng dương tính nếu kết tủa xuất hiện.
Alkaloid
Bouchardat Hỗn hợp KI+I2/HCL
Phản ứng dương tính nếu có màu đỏ thẫm
vansMayer Hỗn hợp HgCL2+ KI
Phản ứng dương tính nếu có kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt. Dragendorf Phản ứng dương tính nếu có kết
tủa màu da cam.
Glycoside Keller-Killian
Phản ứng dương tính nếu xuất hiện vòng đỏ nâu ở bề mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng.
Polyphenol khác
Dung dịch kiềm Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu vàng.
FeCL3/HCL Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu lục, xanh, đen.
2.2.2.2. Định lƣợng pholyphenol tổng số theo phƣơng pháp Folin Ciocalteau
Nguyên tắc: dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol (trong mẫu) với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam. So màu trên máy quang phổ UV VIS 1000 ở bước sóng λ = 765 nm, dùng chất chuẩn là acid gallic [35].
Các bước tiến hành như sau:
32
Dung dịch acid gallic; 0.5 g acid gallic + 10ml C2H5OH + 90ml H2O bảo quản lạnh. Như vậy dịch chuẩn gốc aid gallic có nồng độ 5mg/ml.
Dung dịch Na2CO3; 200g Na2CO3 + 800ml H2O đun sôi. Thêm một vài giọt tinh thể Na2CO3, sau 24 giờ đem lọc và dẫn nước cất tới 1000ml.
Dung dịch mẫu cần định lượng.
* Tiến hành xây dựng đường chuẩn acid gallic.
Chuẩn bị cốc định lượng theo số lượng dung dịch gốc như sau: 0,1, 2, 3, 5 và 10ml sau đó dẫn nước cất tới 100ml ta thu được các nồng độ 0, 50, 100, 150, 250, và 500mg/l acid gallic.
Cho vào mỗi cuvert 20 µl mẫu thử (dung dịch gallic chuẩn ở các nồng độ hoặc dịch chiết các phân đoạn ) + 1.58 ml H2O + 100µl thuốc thử Folin- Ciocalteau sau 30 giây đến 8 phút cho thêm 300 µl Na2CO3. Để hỗn hợp dunh dịch phản ứng trong hai giờ ở 200c rồi xác định ở bước sóng 765 nm. Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn.
Định lượng phenolic của mẫu nghiên cứu bằng cách lấy 20 µl để định lượng tương tự như đã làm với mẫu chuẩn aicd gallic.
2.2.3. Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết các phân đoạn cây Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.) lên trọng lƣợng và một số chỉ số hóa sinh máu của chuột BP thực nghiệm
2.2.3.1. Thử độc tính cấp, xác định LD50
Xác định LD50 của dịch chiết cây Vũ sữa đất theo phương pháp Lorke [17]. Chuột nhịn đói trước 16 giờ thí nghiệm được phân lô ngẫu nhiên N=10 và cho uống theo liều tăng dần cho đến 8g/kg (thể tích và khối lượng tối đa cho ph p ). Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết cây Vú sữa đất .
33
2.2.3.2. Xây dựng mô h nh chuột BP thực nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, sau khi mua về chuột được chăm sóc bình thường trong 3-4 ngày để thích ứng với môi trường mới sau đó tiến hành phân chuột thành 2 nhóm với hai chế độ dinh dưỡng như sau:
Nhóm 1 - Nhóm đối chứng: Các con chuột tiếp tục được chăm sóc bằng thức ăn bình thường (do viện Vệ sinh Dịch tễ cung cấp). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhóm 2 - Nhóm nuôi béo: Các con chuột được chăm sóc bằng chế độ thức ăn giàu lipid và cholesterol.
Các nhóm chuột được theo dõi trong vòng 8 tuần, trọng lượng của các con chuột được kiểm tra hàng tuần. Vào tuần cuối cùng thời gian thí nghiệm, sau khi xác định trọng lượng, chúng tôi tiến hành lựa chọn ngẫu nhiên từ mỗi nhóm ra 10 con chuột, lấy máu tổng số và phân tích một số chỉ số lipid máu. Các số liệu được thu thập và tiến hành xử lý thống kê.
2.2.4. Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Aflolien60 F245 (Merck) RP18F245 (Merck) bằng hệ dung môi Toluen:Ethylaxetat:Aceton:Acid Formic(TEAF) 5:3:1:1. Dùng chất hiện màu là H2SO4 10%,sấy kho trên bếp điện từ đến khi hiện màu.
2.2.5. Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết của dịch chiết cây Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.) lên chuột nhắt gây ĐTĐ ằng STZ
Để tìm hiểu tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết cây Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.), trước tiên chúng tôi tiến hành gây mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2 dựa trên chế độ ăn giàu chất b o kết hợp với STZ liều đơn của Srinivasan.
2.2.5.1. Phƣơng pháp gây ĐTĐ thực nghiệm mô phỏng type 2
Chuột nuôi BP được gây ĐTĐ type 2 bằng tiêm STZ (110mg/kg pha trong đệm citrate 0.01M, pH = 4.3) dưới màng bụng, gây rối loạn trao đổi glucose máu của chuột BP thực nghiệm nhằm tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2
34
phát triển từ BP. Trước khi thí nghiệm cho chuột nhịn đói 16h. Sau đó chúng được uống nước và ăn bình thường. Sau từ 3- 4 ngày những con chuột này bị bệnh với nồng độ glucose huyết được xác định ≥ 18mmol/l [9], [11]. Tiến hành phân các lô chuột (mỗi lô gồm 5 con) đã bị bệnh để nghiên cứu khả năng hạ đường huyết khi sử dụng các phân đoạn dịch chiết từ Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.).
Lô 1: Lô STZ nhóm đối chứng không điều trị Lô 2: Lô STZ điều trị bằng phân đoạn EtOH Lô 3: Lô STZ điều trị bằng phân đoạn n-hexan Lô 4: Lô STZ điều trị bằng phân đoạn EtOAc
Chuột bị bệnh uống điều trị các phân đoạn dịch chiết từ Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.), được tiến hành đo nồng độ glucose huyết của chuột ở các thời điểm khác nhau (2h, 4h, 8h, 10h) và tiến hành các x t nghiệm tiếp theo. Sau đó tiếp tục điều trị cho chuột trong vòng 21 ngày (3 tuần).
2.2.5.2. Thử khả n ng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết từ
cây Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.)trên mô h nh chuột ĐTĐ type 2
Các lô chuột ĐTĐ type 2 (5 con/lô) được ăn thức ăn thường và điều trị hằng ngày bằng cách cho uống phân đoạn dịch chiết từ cây Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.) với liều 2000mg/kg. Đường huyết của các con chuột được đo vào cùng một thời điểm trong ngày và sau khi nhịn đói 12 giờ ở các ngày thứ 0 (trước khi điều trị), ngày thứ 5, 10, 15, 21 khi điều trị.
35
Bảng 2.3. Mô hình nghiên cứu khả n ng hạ glucose của các phân đoạn
dịch chiết từ cây Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.)
Lô Chế độ n
trƣớc điều trị Tiêm Mục đích
1 Thức ăn chuẩn Uống nước cất, không điều trị. 2 Thức ăn béo STZ Uống nước cất, không điều trị.
3 Thức ăn b o STZ Điều trị cao phân đoạn ethanol (2000mg/kg) 4 Thức ăn b o STZ Điều trị cao phân đoạn n-hexan(2000mg/kg 5 Thức ăn b o STZ Điều trị cao phân đoạn ethylacetate (2000mg/kg)
2.2.6. Sử dụng phƣơng pháp hóa sinh - y dƣợc 2.2.6.1. Phƣơng pháp định lƣợng glucose huyết
* Nguyên tắc:
Nguyên tắc hoạt động của phương pháp dựa trên chuỗi phản ứng tạo màu và được đo bằng phương pháp quang học để định lượng glucose huyết.
+ Phản ứng 1: Khi máu tiếp xúc với bề mặt của vùng phản ứng que thử, dưới xúc tác đặc hiệu của glucose oxidase (GOD) có trong kít thử, glucose trong máu phản ứng với oxy (không khí) tạo thành axit gluconic và hydro peroxide (H2O2).
+ Phản ứng 2: Hydro peroxide vừa tạo ra sẽ phản ứng với O-Dianisidin tạo phức màu và được thiết bị đo quang học trong máy One Touch Ultra chuyển hóa định lượng biểu thị bằng số mol/L hoặc mg/dl glucose.
* Tiến hành: Ấn nút điều khiển để khởi động máy. Gắn que thử vào máy. Dùng kim châm chuyên dụng châm vào mạch máu ở đuôi chuột, để máu chảy tự nhiên, thấm bỏ giọt đầu tiên, lấy giọt máu thứ 2. Mẫu máu dùng cho việc đo là 1µL, phải là giọt máu tròn đầy, phủ kín giọt máu lên vùng phản ứng của que thử. Sau 5 giây, kết quả nồng độ đường huyết sẽ hiển thị trên màn hình.
36
Hình 2.3. Phương pháp ấy máu o g ucose huyết (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.6.2. Định lƣợng một số chỉ số lipid trong huyết thanh
Các chỉ số lipid huyết thanh (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL-c, LDL-c) được xác định trên máy x t nghiệm sinh hóa tự động (Phòng hóa sinh – Bệnh viện Hữu nghị Việt - Xô). Nguyên tắc xác định của mỗi chỉ số như sau:
a) Định lượng triglycerid
Thuỷ phân triglycerid bằng enzyme lipase, định lượng glycerol giải phóng ra bằng phương pháp đo màu của quynonimin tạo thành từ
4- aminoantipyrin và 4-chlorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo các phản ứng sau:
Triglycerid Glycerol + acid béo
Glycerol + ATP Glycerol-3-phosphate + ADP Glycerol-3-phosphate + O2 Dihidroxyacetone + H2O2
H2O2 + Aminoantipyrine + 4- chlorophenol Quynonimin + 4HCl + 4H2O
Đo mật độ quang học quynonimin ở bước sóng 546nm (máy Olympus AU400) rồi so với chuẩn để tính kết quả.
) Định lƣợng cholesterol toàn phần
Thuỷ phân cholesterol este bằng enzyme cholesterol esterase (CHE) và oxy hoá bằng cholesterol oxydase (CHO). Đo mật độ quang của quynonimin
Lipase Glycerolkinzase
GPO
37
tạo nên từ phản ứng của hydrogen peroxide với 4-aminophenazone và phenol nhờ xúc tác của peroxydase. Các phản ứng:
Cholesterol este + H2O Cholesterol + acid béo Cholesterol + O2 Chlesterol-3-one + H2O
H2O2 + 4-aminophenazone + Phenol Quynonimin + H2O Đo mật độ quang của Quynonimin ở bước sóng 546nm (bằng máy Olympus AU400), so với ống chuẩn để tính kết quả.
c) Định lƣợng HDL-c
Nguyên tắc: X t nghiệm gồm hai bước đặc hiệu. Bước thứ nhất cholesterol trong chylomicron, LDL, LDL bị loại bỏ và phá hủy bằng các phản ứng enzyme đặc hiệu. Bước thứ hai cholesterol trong HDL được định lượng bằng phản ứng enzyme với sự có mặt của chất surfactant đặc hiệu cho HDL. Bước 1: Chylomicron, LDL, LDL Cholestenon + H2O 2H2O2 2 H2O + O2 Bước 2: HDL Cholestenon + H2O2 H2O2 + Chromogen Sắc tố quynon 2.2.7 . Xử lý số liệu.
Chỉ số glucose huyết được so sánh giữa thời điểm trước và sau nghiên cứu; so sánh giữa các lô dùng thuốc và lô đối chứng ở cùng thời điểm.
* Tỷ lệ tăng glucose huyết được tính theo công thức
Tỷ lệ % tăng glucose huyết:
X1% = CHE CHO Peroxydase B – A A x 100 CHE + CHO
Điều kiện đặc biệt
Catalase
CHE + CHO Surfactant đặc hiệu
38
X1 – Tỷ lệ % tăng glucose huyết
A – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm ban đầu B – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm đánh giá
Sự khác biệt được kiểm định bằng thuật toán t- test student với p < 0.05 có ý nghĩa thống kê. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Tỷ lệ hạ glucose huyết, (CHL, HDL-C, LDL-C, TG) được tính theo công thức dưới đây
Tỷ lệ % hạ glucose huyết:
X2% =
X2 – Tỷ lệ % hạ glucose huyết
A – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm ban đầu B – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm đánh giá
Sự khác biệt được kiểm định bằng thuật toán t- test student với p < 0.05 có ý nghĩa thống kê.
B - A A
39
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết và một số đặc tính hoá sinh của phân đoạn dịch
chiết từ cây Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.)
3.1.1. Quy tr nh tách các phân đoạn dịch chiết từ cây Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.)
Từ 3000g cây Vú sữa đất tiến hành ngâm kiệt 3 lần với ethanol 90% mỗi lần ngâm là 10 L , sau đó tiến hành lọc thu được dung dịch , cô cạn trên bóng đèn 200W thu được 150g cao cồn , sau đó tiếp tục ngâm mẫu Vú sữa đất với 5L n-Hexan tiến hành tương tự ta thu được 34,6 g cao n-Hexan , sau đó tiếp tục ngâm mẫu với 5L Ethylacetate làm tương tự ta thu được 31g cao Ethylacetate
H nh 3.1. Quy tr nh chiết xuất các chất tự nhiên từ cây Vú sữa đất
3000g Vú sữa đất Ngâm kiệt 3 lần với ethanol90% bã Vú sữa đất Ngâm kiệt với Ethyacetate Lọc , thu dung dịch , cô cạn Lọc thu dung dịch , cô cạn Cao PĐ ethanol
Ngâm kiệt với n-Hexan Lọc, thu dung dịch, cô cạn Cao PĐ n- Hexan Cao PĐ Ethylacetate
40
3.1.2. Kết quả định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên trong các phân
đoạn dịch chiết từ cây Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.)
Để xác định thành phần hợp chất tự nhiên có trong dịch chiết các phân đoạn (PĐ) của cây Vú sữa đất đã cô thành cao gồm có: Cao EtOH, n- hexan, EtOAc. Chúng tôi tiến hành định tính thành phần một số hợp chất tự nhiên thông qua các phản ứng hóa học và một số thuốc thử tương ứng. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2 kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân
đoạn dịch chiết từ cây Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.)
Nhóm chất Phản ứng đặc trƣng Vú Sữa Đất 1 2 3 Flavonoid Shinoda ++ + +++ Diazo +++ ++ +++ NaOH 10% ++ + +++ H2SO4 + + ++ Tannin Vanillin + - + FeCl3/HCl ++ ++ +++ Gelatin ++ ++ +++ Acetate chì ++ + +++ Alkaloid Dragendorf ++ + ++ Mayer + + + Bouchardat + + + Glycoside Keller-Kilian ++ ++ +++ Saponin Tạo bọt + + + Chú thích: (-): Không phản ứng (+): Phản ứng (++): Phản ứng mạnh (+++): Phản ứng rất mạnh (1)- Cao ethanol,
(2) - Cao phân đoạn n-hexan (3)-Caophân đoạn ethylacetate
41
Từ kết quả các phản ứng định tính cho thấy thành phần các hợp chất tự nhiên trong Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.) khá phong phú bao gồm: Flavonoid, tannin, glycoside, alkaloid và saponin. Cao của cả 3 phân đoạn EtOH, n-hexan, và EtOAc đều chứa các thành phần này nhưng với hàm lượng khác nhau. Căn cứ vào mức độ phản ứng cho thấy cao phân đoạn EtOAc phản ứng với các thuốc thử nhận biết flavonoid, tannin và alkaloid mạnh hơn so với phản ứng nhận biết saponin đồng thời mạnh hơn phản ứng của các cao phân đoạn khác. Như vậy, cao phân đoạn EtOAc chứa hàm lượng các chất tự nhiên lớn và phong phú nhất. Tiếp theo là phân đoạn EtOH. Phân đoạn n-hexan chứa ít các hợp chất tự nhiên hơn.
3.1.3. Phân tích thành phần các hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn
dịch chiết cây Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.) bằng sắc kí lớp mỏng
Chúng tôi đã tiến hành chạy sắc kí bản mỏng tráng sẵn silicagel Merck Alufolien 60 F254 với nhiều hệ dung môi khác nhau. Qua thăm dò cho thấy hệ dung môi TEAF (5:3:1:1) (Toluen-Ethylacetate-Acetone-acid Formic) là cho kết quả rõ n t nhất và được chúng tôi lựa chọn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.2. Sắc ký ồ các phân oạn
Kết quả sắc ký đồ hình 3.2 cho thấy bản sắc ký xuất hiện nhiều băng vạch có màu sắc khác nhau.
Chú thích:
1: Cao n – Hexan