đoạn dịch chiết từ cây Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.)
Để xác định thành phần hợp chất tự nhiên có trong dịch chiết các phân đoạn (PĐ) của cây Vú sữa đất đã cô thành cao gồm có: Cao EtOH, n- hexan, EtOAc. Chúng tôi tiến hành định tính thành phần một số hợp chất tự nhiên thông qua các phản ứng hóa học và một số thuốc thử tương ứng. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2 kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân
đoạn dịch chiết từ cây Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.)
Nhóm chất Phản ứng đặc trƣng Vú Sữa Đất 1 2 3 Flavonoid Shinoda ++ + +++ Diazo +++ ++ +++ NaOH 10% ++ + +++ H2SO4 + + ++ Tannin Vanillin + - + FeCl3/HCl ++ ++ +++ Gelatin ++ ++ +++ Acetate chì ++ + +++ Alkaloid Dragendorf ++ + ++ Mayer + + + Bouchardat + + + Glycoside Keller-Kilian ++ ++ +++ Saponin Tạo bọt + + + Chú thích: (-): Không phản ứng (+): Phản ứng (++): Phản ứng mạnh (+++): Phản ứng rất mạnh (1)- Cao ethanol,
(2) - Cao phân đoạn n-hexan (3)-Caophân đoạn ethylacetate
41
Từ kết quả các phản ứng định tính cho thấy thành phần các hợp chất tự nhiên trong Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.) khá phong phú bao gồm: Flavonoid, tannin, glycoside, alkaloid và saponin. Cao của cả 3 phân đoạn EtOH, n-hexan, và EtOAc đều chứa các thành phần này nhưng với hàm lượng khác nhau. Căn cứ vào mức độ phản ứng cho thấy cao phân đoạn EtOAc phản ứng với các thuốc thử nhận biết flavonoid, tannin và alkaloid mạnh hơn so với phản ứng nhận biết saponin đồng thời mạnh hơn phản ứng của các cao phân đoạn khác. Như vậy, cao phân đoạn EtOAc chứa hàm lượng các chất tự nhiên lớn và phong phú nhất. Tiếp theo là phân đoạn EtOH. Phân đoạn n-hexan chứa ít các hợp chất tự nhiên hơn.
3.1.3. Phân tích thành phần các hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn
dịch chiết cây Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.) bằng sắc kí lớp mỏng
Chúng tôi đã tiến hành chạy sắc kí bản mỏng tráng sẵn silicagel Merck Alufolien 60 F254 với nhiều hệ dung môi khác nhau. Qua thăm dò cho thấy hệ dung môi TEAF (5:3:1:1) (Toluen-Ethylacetate-Acetone-acid Formic) là cho kết quả rõ n t nhất và được chúng tôi lựa chọn.
Hình 3.2. Sắc ký ồ các phân oạn
Kết quả sắc ký đồ hình 3.2 cho thấy bản sắc ký xuất hiện nhiều băng vạch có màu sắc khác nhau.
Chú thích:
1: Cao n – Hexan 2: Cao EtOAc 3: Cao EtOH
42
Qua quan sát trên sắc ký đồ, chúng tôi nhận thấy kết quả sắc ký đồ của các phân đoạn dịch chiết từ cây Vú Sữa Đất đều cho nhiều băng vạch với nhiều màu sắc, các băng vạch nằm gối lên nhau. Màu sắc các băng vạch gồm các màu chủ yếu như: Màu vàng (flavonoid), màu tím (tecpen), màu xanh (diệp lục) chứng tỏ trong các phân đoạn dịch chiết từ cây Vú Sữa Đất chứa thành phần polyphenol khá phong phú. Phân đoạn EtOAc, phân đoạn EtOH cho các băng đậm với các màu tím, nâu đỏ, vàng nhạt và xanh.Số vạch ở hai phân đoạn này dao động từ 11 đến 15 vạch trong đó có nhiều vạch trùng nhau hoặc gối lên nhau. Phân đoạn n-hexan có khá it băng vạch, số lượng băng vạch là 6.
Như vậy cho thấy phân đoạn EtOAc chiếm lượng polyphenol nhiều nhất.
3.1.4. Định lƣợng hàm lƣợng polyphenol tổng số trong cao dịch chiết các
phân đoạn từ cây Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.)
3.1.4.1. Xây dựng đƣờng chuẩn gallic acid
Đường chuẩn gallic acid được xây dựng bằng cách chuẩn bị các dung dịch gallic acid ở các nồng độ 50, 100, 150, 250, 500mg/l, tiến hành so màu trên máy ERMA ở bước sóng λ=765nm. Kết quả được thể hiện ở hình 3.3 và bảng 3.3.
43
Bảng 3.3 Kết quả đƣờng chuẩn gallic
H nh 3.3. Đồ thị chuẩn gallic acid
3.1.4.2. Định lƣợng polyphenol tổng số theo phƣơng pháp Folin- Ciocalteau
Định lượng polyphenol của dịch chiết các phân đoạn bằng phương pháp Folin- Ciocalteau. Dịch chiết mẫu cho phản ứng với thuốc thử Folin- Ciacalteau tạo ra sản phẩm có màu xanh lam. So màu trên máy ERMA ở bước sóng λ = 765 nm, dùng chất chuẩn là acid gallic để tính lượng polyphenol. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Hàm lƣợng polyphenol tổng số trong các PĐ dịch chiết Mẫu PĐ Vú sữa đất OD765nm Hàm lƣợng polyphenol(mg/l) Tỷ lệ (%) EtOH 0.578 565.2 18,84 n-hexan 0.640 627.2 20,906 EtOAc 0.860 847.2 28,24 ST T Gallic acid (mg/l) OD 765nm 1 0 0.009 2 50 0.062 3 100 0.119 4 150 0.168 5 250 0.265 6 500 0.519
44
Kết quả bảng 3.4 cho thấy hàm lượng polyphenol trong phân đoạn cao EtOAc là nhiều nhất chiếm 18.84 %, tiếp đó là phân đoạn n – Hexan chiếm 20,906% và EtOH 28,24 %.
3.2. Kết quả xác định liều độc cấp
Xác định LD50 của dịch chiết tổng số từ cây Vú sữa đất trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp của Lorke. Chuột cho nhịn đói trước 16 giờ thí nghiệm, được phân lô ngẫu nhiên, mỗi ô 5 con và được cho uống theo liều tăng dần đến 8g/kg thể trọng. Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết cây Vú sữa đất
Bảng 3.5. Kết quả thử độc tính cấp theo đƣờng uống
Liều uống mg/kg Tổng số chuột Số chuột chết % chuột chết
6500mg/kg 10 0 0%
7000mg/kg 10 0 0%
7500mg/kg 10 0 0%
8000mg/kg 10 0 0%
Sau 72 giờ theo dõi với các liều 6500, 7000, 7500, 8000 mg/kg thể trọng thấy không có con chuột nào chết. Đến liều cao nhất 8000mg/kg thể trọng cũng không có con nào chết, vì vậy chưa tính được LD50, nghĩa là có thể kết luận các phân đoạn dịch chiết từ cây cỏ sữa lá to hoàn toàn không độc dù là liều rất cao theo đường uống.
3.3. Kết quả tạo mô hình chuột béo phì thực nghiệm
Chuột nhắt trắng (Muss musculus) chủng Swiss (khối lượng ban đầu là 18-20g) được chia làm 8 lô.
Lô 1: Cho ăn chế độ bình thường (thức ăn của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương). Lô 2-8: Cho ăn thức ăn giàu lipid và cholesterol (Bảng 3.6).
45
Hình 3.4. Chuột nuôi ở chế ộ ăn béo (B) ăn chuẩn (A)
Sau 8 tuần nuôi theo chế độ trên, chúng tôi tiến hành cân trọng lượng chuột. Kết quả sự thay đổi trọng lượng của chuột thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.7 sau: Thành phần Hàm lƣợng (%) Hydatcacbon 30 Cazein 25 Cholesterol 10 Lipid 20 Vitamin 5 Chất khác 10 A B
46
Bảng 3.7. Trọng lƣợng trung bình của hai nhóm chuột nuôi ằng hai chế độ dinh dƣỡng khác nhau
(Số liệu thể hiện trong bảng là giá trị trung bình của các lô chuột; (*): p < 0.05 so sánh với nhóm ăn thường)
0 10 20 30 40 50 60 70 ban
đầu tuần 1 tuần 2 tuần3 tuần4 tuần5 tuần6 tuần7 tuần8
14.8 16.6 23.4 27.7 31.8 34.7 37.8 40.1 42.8 14.8 20.2 31.5 36.6 42.2 47.6 52.6 59.2 63.4 nuôi thường nuôi béo
Hình 3.5. Bi u ồ bi u diễn sự tăng trọng của nhóm chuột với 2 chế ộ dinh dưỡng khác nhau trong vòng 8 tuần
Qua tham khảo và thử nghiệm chúng tôi đã thành công trong việc tạo mô hình chuột BP thực nghiệm bằng cách cho chuột ăn thức ăn giàu lipid,
Nhóm chuột
Trọng lƣợng trung nh của chuột tại các thời điểm khác nhau (g) Ban đầu Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5 Tuần 6 Tuần 7 Tuần 8 Nhóm ăn thường 14.80 16.60 23.40 27.70 31.80 34.70 37.80 40.10 42.80 Nhóm ăn béo 14.80 20.02 31.50 36.60 42.20 47.60 52.60 59.20 63.40 (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*)
47
cholesterol. Khi sấy khô chúng tôi có bổ sung thêm một lượng lớn cholesterol trong lòng đỏ trứng gà và lượng lipid trong mỡ lợn. Sau 8 tuần nuôi theo chế độ ăn như trên, chúng tôi thấy có sự khác nhau rõ rệt về khối lượng của chuột nuôi bằng thức ăn giàu lipid so với chuột nuôi bằng chế độ ăn thường và sự sai khác này là có ý nghĩa p < 0.05.
Biểu đồ hình 3.5 đã cho thấy:
Tại thời điểm ban đầu sự khác nhau về trọng lượng không có ý nghĩa thống kê (p >0.05).
Trong tuần đầu tiên, khi nuôi với chế độ thức ăn giàu lipid trọng lượng chuột đã tăng có ý nghĩa thống kê toán học (p <0.01).
Sau 8 tuần, chuột nuôi với thức ăn thường trọng lượng cơ thể chỉ tăng thêm 15.42g ứng với 84.72% so với ban đầu, trong khi chuột nuôi với thức ăn có hàm lượng lipid và cholesterol cao trọng lượng cơ thể tăng thêm 46.59g ứng với 243.92% ở mức ý nghĩa p<0.05 so với lô đối chứng.
Kết thúc 8 tuần sau quá trình nuôi với chế độ thức ăn giàu chất b o, trọng lượng chuột nuôi b o nặng 65.69g, với mức ý nghĩa (p<0.05) so với lô đối chứng.
Qua đó có thể kết luận chuột được nuôi bằng thức ăn giàu lipid đã bị BP. Những nghiên cứu về chuyển hoá các chất ở tế bào và mô cho thấy khi tiêu thụ chất b o vượt quá nhu cầu năng lượng của cơ thể thì chất b o được tích tụ ở mô mỡ gây BP. Như vậy, chế độ ăn giàu chất b o bão hoà là một trong những yếu tố nguy cơ gây nên bệnh BP cũng như các bệnh mãn tính liên quan.
Tuy nhiên để có thêm cơ sở cho kết luận này, chúng tôi tiến hành xác định một số chỉ số lipid và glucose trong máu chuột của các lô chuột thí nghiệm này. Các chỉ số lipid trong huyết thanh của chuột được lấy vào ngày cuối cùng của thời gian nuôi b o sau khi cho nhịn đói qua đêm, chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên 5 con chuột, lấy máu tổng số và phân tích một số chỉ số hoá sinh. Kết quả được thể hiện trong hình 3.6 và bảng 3.8
48
Bảng 3.8. So sánh một số chỉ số hóa sinh máu giữa chuột nuôi thƣờng và nuôi béo phì thực nghiệm.
(*): p<0.05 khi so sánh với nhóm ăn thường
Hình 3.6. Bi u ồ so sánh một số chỉ số hóa sinh giữa các lô chuột thí nghiệm
Kết quả ở biểu đồ hình 3.6 cho thấy các lô chuột ăn thức ăn có hàm lượng lipid cao đều có rối loạn một số chỉ số lipid máu so với lô chuột ăn thức ăn bình thường. Hàm lượng cholesterol toàn phần, triglycerid, LDL-c, Glucose trong huyết thanh của nhóm chuột nuôi b o tương ứng tăng gấp 23.16%, 58.78%,
Nhóm
Các chỉ số lipid (mmol/l) Glucose
(mmol/l) TC TG HDL-c LDL-c Nhóm ăn thường 4.36±0.20 1.48±0.38 1.65±0.26 0.69±0.11 6.66±0.12 Nhóm ăn béo 5.37*±0.11 2.35*±0.21 1.48*±0.19 1.67*±0.24 9.46*±0.19 (↑23.16%) (↑58.78%) (↓10.3%) (↑142.02%) (↑42%)
49
142.02% và 42% so với nhóm chuột nuôi bằng thức ăn thường một cách có ý nghĩa (p<0.05). Trong khi đó, hàm lượng HDL ở nhóm chuột nuôi bằng thức ăn b o lại giảm hơn một cách rõ rệt (giảm 10.3%). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với qui luật thực tế và với nghiên cứu của Srinivasan và cộng sự Điều đó chứng tỏ chuột ăn các thức ăn có hàm lượng lipid cao thời gian dài rất dễ rối loạn trao đổi lipid và glucid. Cụ thể là:
Hàm lượng glucose của chuột BP là 9.46 mmol/l, tăng 42% so với chuột nuôi thường (6.66mmol/l) với mức ý nghĩa p<0.05.
Nồng độ cholesterol của chuột BP là 5.37mmol/l, tăng 23.16% so với lô nuôi thường (4.36mmol/l) với p < 0.05.
Triglycerid của chuột BP là 2.35mmol/l, tăng 58.78% so với lô nuôi thường (1.48mmol/l) với p < 0.005.
Hàm lượng LDL-c trong máu chuột BP là 1.67mmol/l, tăng 142.02% so với lô chuột nuôi thường (0.69mmol/l) với p < 0.05. Trái lại, HDL-c lại có sự sụt giảm mạnh, giảm tới 10.3% so với chuột nuôi thường (1.48mmol/l), với p<0.05.
Kết quả trên có thể giải thích là do chuột được ăn thức ăn có thành phần giàu lipid (20%) và cholesterol (10%) nên các chỉ số triglycerid và cholesterol toàn phần trong máu tăng chủ yếu là do thu nhận từ quá trình tiêu hoá. Cholesterol tuy cần thiết cho cơ thể vì nó là hợp phần cấu tạo của màng tế bào, của các mô thần kinh, các hormon steroid và quá trình tổng hợp vitamin D, nhưng khi cholesterol máu tăng cao quá mức lại trở nên có hại cho cơ thể vì khi đó nó trở thành nguyên nhân gây ra nhiều bệnh nguy hiểm như xơ vữa động mạch, bệnh lý tim mạch…[4] là những bệnh lý thường gặp ở bệnh nhân BP.
Triglycerid hay mỡ trung tính là thành phần chủ yếu của dầu, mỡ động thực vật, không tan trong máu nên được vận chuyển dưới dạng các hạt lipoprotein như chylomicron, LDL (lipoprotein có tỷ trọng rất thấp) …đến
50
trao đổi với các mô. Tế bào của mô hấp thụ triglycerid và tiêu dùng theo nhu cầu, khi dư thừa nó tích tụ trong tế bào và trở thành dạng năng lượng dự trữ trong các mô mỡ. Trong thời gian dài chuột luôn có chế độ ăn dư thừa triglycerid nên không những trọng lượng tăng mà hàm lượng triglycerid trong máu cũng ứ đọng rất cao.
Các lipid chính có mặt trong máu là acid b o tự do, triglycerid (TG), cholesterol toàn phần (TC) và các phospholipids (PL). Vì không tan trong nước, lipid được vận chuyển trong máu dưới dạng kết hợp với các protein đặc hiệu. Các acid b o tự do được vận chuyển yếu bởi albumin, các lipid khác được lưu hành trong máu dưới dạng các phức hợp lipoprotein. Có nhiều loại lipoprotein: loại có tỉ trọng cao có tên là HDL, loại có tỉ trọng thấp có tên là LDL, loại có tỉ trọng rất thấp có tên là LDL và HDL có chức năng vận chuyển cholesterol và LDL có chức năng vận chuyển triglycerid trong máu. Cholesterol kết hợp với LDL (Low density lipoprotein) được ký hiệu là LDL- c là dạng cholesterol gây hại cho cơ thể chúng vận chuyển cholesterol vào trong máu thấm vào thành mạch máu chúng có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành mảng xơ vỡ động mạch, tắc nghẽn động mạch ở người BP, dễ gây nhồi máu cơ tim và đột tử khi gây tắc mạch máu não.
Cholesterol kết hợp với HDL (hight density lipoprotein) được ký hiệu là HDL-c là một dạng cholesterol có lợi cho cơ thể chúng chống lại quá trình xơ vỡ động mạch bằng cách chuyển cholesterol dư thừa từ trong thành mạch máu trở về gan [24].
Như vậy với sự tăng trọng lượng cơ thể, tăng glucose huyết cùng với các chỉ số mỡ máu tăng cao (TC, TG, LDL-c) và giảm HDL-c ở chuột cũng như những hiểu biết về quá trình chuyển hoá lipid, chúng tôi có thể kết luận rằng mô hình gây chuột BP bằng các chế độ ăn giàu chất b o đã thành công. Chuột BP được tiếp tục sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.
51
3.4. Tác dụng hạ glucose huyết của một số phân đoạn dịch chiết từ cây
Vú sữa đất trên mô hình chuột ĐTĐ type 2
3.4.1. Kết quả tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2 thực nghiệm
Chuột nuôi BP đến ngày thứ 60, trước khi thí nghiệm, cho chuột nhịn đói 12- 16 giờ, sau đó chuột BP được tiêm màng bụng liều đơn STZ (110 mg/kg). Sau từ 3- 4 ngày những con chuột này bị bệnh với nồng độ glucose huyết được xác định ≥ 18mmol/l [9].
STZ (Streptozotocin) có tên hóa học là: 2 - deoxy - 2 - (3 - metyl - 3 - nitrosoureido) - D - glucopyranose, được phân lập đầu tiên vào năm 1960 từ
Streptomyces achromogens. Đây là kháng sinh có hoạt tính chống ung thư, tiêu u, sinh u và gây ĐTĐ. Tác dụng gây ĐTĐ của STZ là do sự phá hủy chọn lọc tế bào bài tiết insulin của tuyến tụy (tế bào ). Do đó STZ được sử dụng rộng rãi trong mô hình động vật ĐTĐ type 1 và type 2 phục vụ trong các nghiên cứu về thuốc [15], [16], [19], [21].
Trước khi thí nghiệm, cho chuột nhịn đói 12- 16 giờ, sau đó chuột BP được tiêm màng bụng STZ (pha trong đệm Citrat 0.01M, pH 4.5) với liều đơn 110 mg/kg thể trọng.
Bảng 3.9. Nồng độ glucose huyết của các lô chuột trƣớc và sau khi tiêm STZ
Các lô chuột Nồng độ glucose huyết (mmol/l)
Trƣớc khi tiêm Sau khi tiêm 72 giờ
Chuột thường tiêm đệm 6.18±0.21 6.57±0.25 Chuột thường tiêm STZ
(110mg/kg) 6.15±0.26
8.02±0.14 P<0.001 Chuột b o phì tiêm đệm 7.09±0.17 7.36±0.32 Chuột b o phì tiêm STZ 7.40±0.23 23.38±3.84
52
(110mg/kg) p<0.001
(Ghi chú: p- là mức ngh a so với th i đi m trước khi tiêm)
Nhận x t:
- Giữa chuột b o và chuột thường có tăng nhẹ về mức glucose huyết (trước khi tiêm). Cụ thể mức glucose ở chuột nuôi chế độ ăn b o trong thời gian 8 tuần có mức glucose huyết tăng so với chuột thường. Điều này chứng tỏ, những rối loạn về chuyển hóa lipid rất dễ dẫn đến rối loạn chuyển hóa glucid. Các quá trình chuyển hóa trong cơ thể luôn có mối quan hệ biện chứng chặt chẽ.
- Đã có sự khác nhau nồng độ glucose huyết của chuột thường tiêm STZ so với nồng độ glucose huyết của chuột thường tiêm đệm (tương ứng là