Dựa vào tác dụng và cơ chế tác dụng, các thuốc điều trị bệnh ĐTĐ được chia thành các nhóm chính:
- Các thuốc giảm đường huyết -Insulin
-Glucosidase Inhibitors -Thiazolidinediones -Tainsulin
1.3.6. Đái tháo đƣờng với y học cổ truyền (YHCT).
Theo Đông Y, bệnh ĐTĐ thuộc phạm vi chứng tiêu khát, với ba triệu chứng chủ yếu là ăn nhiều, uống nhiều và tiểu nhiều. Do ăn nhiều các chất cay, b o ngọt làm mất cân bằng âm dương trong cơ thể, tạo thành hỏa nhiệt, uất nhiệt, làm phần âm của phủ tạng như âm, vị thận bị hao tổn. Hỏa nhiệt làm phế hư gây chứng tiêu khát, vị âm gây chứng gầy đói, thận âm hư gây tiểu nhiều và tiểu ra đường. Xuất phát từ quan niệm trên, nên phương pháp điều trị chủ yếu là dưỡng âm, thanh nhiệt sinh tân dịch làm cơ sở để lập lại cân bằng âm dương trong cơ thể [2], [3], [4], [5].
Việt Nam là nước có nguồn dược liệu rất phong phú. Bên cạnh chế độ ăn uống và tập luyện hợp lý thì việc sử dụng thảo mộc trong điều trị bệnh ĐTĐ từ lâu đã được biết đến với nhiều tác dụng tích cực. Các thuốc điều trị bệnh ĐTĐ
24
của Đông Y chủ yếu là các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu. Một số thảo mộc rất sẵn trong nước có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh ĐTĐ [4], [5] như: Bầu đắng, tỏi, nghệ, quế, hành tây, bí đao, mướp đắng, khế, rau muống…
1.4. Mối quan hệ giữa béo ph và đái tháo đƣờng
BP và ĐTĐ là hai bệnh không truyền nhiễm nguy hiểm nhất của thế kỉ 21. Hai căn bệnh này có mối liên quan chặt chẽ với nhau thể hiện ở chỗ tỉ lệ người BP luôn tăng tương đương với số bệnh nhân bị ĐTĐ. Một cuộc khảo sát của Mỹ gần đây đã chỉ ra rằng có tới 58% số người bị ĐTĐ type 2 được quy cho là do BP. BP liên quan tới ĐTĐ type 2 thông qua sự đề kháng insulin [4].
Kết quả của nhiều nghiên cứu cho thấy acid b o tự do có vai trò trong bệnh sinh ĐTĐ type 2. Phần lớn người BP có nồng độ acid b o trong huyết tương tăng cao. Sự tăng này ức chế quá trình hấp thu glucose ngoại vi dưới tác dụng của insulin, ức chế sử dụng glucose.
Có nhiều nhân tố ảnh hưởng tới mối quan hệ giữa BP và bệnh ĐTĐ type 2 bao gồm: chỉ số khối cơ thể, thời gian BP, chế độ dinh dưỡng, sự vận động thân thể. Một thống kê đã chỉ rằng những người có chỉ số khối cơ thể lớn hơn 30kg/m2
trong 10 năm có nguy cơ mắc bệnh ĐTĐ type 2 cao gấp hai lần người bị BP dưới 5 năm và nếu trọng lượng cơ thể tăng một kilogram thì rủi ro về bệnh ĐTĐ type 2 tăng 4.5% . Kết quả của nhiều nghiên cứu cho thấy acid b o tự do có vai trò trong bệnh sinh ĐTĐ type 2. Phần lớn người BP có nồng độ acid b o trong huyết tương tăng cao. Sự tăng này ức chế quá trình hấp thu glucose ngoại vi dưới tác dụng của insulin, ức chế sử dụng glucose của toàn cơ thể, ức chế oxy hóa glucose ở cơ.
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã thấy rằng thừa cân và BP có một mối liên quan chặt chẽ đến tính kháng insulin và bệnh ĐTĐ type 2 và điều đó cũng không loại trừ ở các bệnh nhân ĐTĐ Việt Nam. ĐTĐ đặc trưng bởi sự rối loạn chuyển hóa glucid, sự rối loạn này ảnh hưởng đến môi trường nội môi do đó k o theo hoặc làm quá trình rối loạn chuyển hóa lipit ở mỗi loại
25
ĐTĐ mang những đặc trưng riêng. Đặc trưng chung của rối loạn chuyển hóa lipit trong ĐTĐ là sự tăng triglycerid, giảm HDL-c và LDL-c vẫn nằm trong giới hạn bình thường. Tuy nhiên ở ĐTĐ type1 rối loạn tăng triglycerid sẽ mất đi kiểm soát được glucose máu khác với type 2, rối loạn này có thể vẫn k o dài mặc dù có sự điều trị giảm glucose máu thích hợp. LDL-c của type 2 cũng có thể tăng nhẹ và xuất hiện nhiều LDL-c với kích thước nhỏ và nặng hơn khi việc kiểm soát glucose k m. Đây chính là yếu tố làm tăng nguy cơ bệnh xơ vỡ động mạch.
1.5. Phƣơng pháp gây đái tháo đƣờng STZ
Streptozotocin (STZ: 2-deoxy -2 (3-mety-3 nitrosoureido)-D-glucopyranose) là chất có hoạt tính ung thư được chiết xuất từ nấm Streptomycer achromogens. Khả năng gây ĐTĐ của STZ đã được phát hiện vào năm 1963. Kể từ đó STZ được sử dụng rộng rãi trong mô hình động vật ĐTĐ type 1 và type 2 phục vụ trong các nghiên cứu về thuốc [11].
Streptozotocin
Tùy vào liều lượng STZ và cách thức tiến hành người ta có thể gây ĐTĐ type 1 hay type 2.
ĐTĐ type1: với chuột cống trưởng thành, tiêm liều duy nhất từ 40- 60mg/kg thể trọng.
26
ĐTĐ type 2: với chuột cống, tiêm STZ liều 100mg/kg thể trọng vào ngày đầu tiên sau khi sinh. Với chuột nhắt có thể nuôi với chế độ dinh dưỡng giàu lượng mỡ sau đó tiêm STZ với liều 50-110mg/kg thể trọng cơ thể.
STZ được nhận biết và xâm nhập vào tế bào qua kênh vận chuyển glucose GLUT2. Hoạt động của nó trong tế bào làm tổn thương và alkyl hóa ADN và cuối cùng dẫn tới hoại tử tế bào. Hoạt tính alkyl hóa của STZ do hoạt động của nhóm nitrosourea của nó, đặc biệt là ở vị trí 06
cuả guanine.
1.6. Vài nét về cây Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.)
1.6.1. Mô tả
Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.) là cây thảo, sống hàng năm hay sống dai, có nhựa mủ trắng. Thân mọc thẳng, đôi khi gấp khúc, màu đỏ nhạt, phủ lông rậm. Lá mọc đối, hình bầu dục hoặc hình mác, dài 2-3 cm, rộng 7-13 mm, gốc tròn hơi lệch, đầu nhọn, m p có răng cưa nhỏ, mặt dưới phủ lông
màu xám; cuống lá có lông rậm; lá kèm nhỏ.
Cụm hoa hình cầu, mọc ở kẽ lá gồm rất nhiều hoa; tổng bao hình chuông, có lông ở mặt ngoài 4 tuyến hình trái xoan, 5 thùy hình tam giác nhọn, nhẵn ở mặt trong; nhị 5, bao phấn gần hình cầu, mở ở đỉnh và ở cạnh; bầu có cuống, có lông.
Quả nang, màu trắng nhạt, đường kính 1,5 mm, hạt hình trứng hoặc hình 4 cạnh, mặt ngoài hơi nhăn nheo.
Mùa hoa quả: tháng 5-10.
1.6.2. Phân ố, sinh thái
Vú sữa đất chỉ thấy phân bố ở một số nước thuộc khu vực nhiệt đới Đông Nam Á và Nam Á gồm Ấn Độ, Malaysia, Philippin, Thái Lan, Lào, Việt Nam và một số nơi ở phía nam Trung Quốc.
Ở Việt Nam, Vú sữa đất phân bố tương đối phổ biến ở hầu hết các tỉnh, từ đồng bằng đến miền núi, trừ vùng núi cao lạnh. Cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu bóng, thường mọc trên đất ẩm, còn tương đối màu mỡ, lẫn
27
với các loài cỏ khác trên các bãi hoang, vườn nhà hay ruộng đồng hoa màu (ngô, đỗ, lạc…). So với Cỏ sữa lá nhỏ, nơi mọc và khả năng chịu hạn của Vú sữa đất bị hạn chế hơn. Vòng đời của nó thường từ 3 đến 5 tháng, ra hoa kết quả xong là tàn lụi. Hạt giống phát tán gần, nên các cây con thường mọc thành đám ở khu vực trước có cây mẹ [18].
28
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1. Mẫu thực vật.
+ Cây Vú sữa đất
+ Bộ phận sử dụng: toàn thân của cây Vú sữa đất
+ Địa điểm thu mẫu: Xuân Hoà – Phúc Yên – Vĩnh Phúc. Sấy khô ở 60ºC sau đó được ngâm kiệt trong Ethanol 90º
, n-hexan , ethylacetate thu dịch cao phục vụ cho các bước nghiên cứu.
29
2.1.2. Mẫu động vật.
Chuột bạch chủng Swiss nặng từ 14 - 20g được nuôi BP và gây ĐTĐ type II do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương cung cấp. Chuột được nuôi trong phòng ở nhiệt độ khoảng 22±20C với chu kỳ ngày 12h và đêm 12h; được ăn bằng thức ăn cho bộ gậm nhấm do Viện Vệ sinh dịch tễ TW cung cấp.
Hình 2.2. Chuột nhắt trắng chủng Swiss
2.1.3. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm.
* STZ (streptozotocin) Sigma, ST.Louse.
* Ethanol 900, hóa chất dùng cho quá trình tách chiết, định tính, định lượng như n-hexan, ethylacetate…
* Máy đo đường huyết tự động One Touch Ultra.
* Bộ kít thử Medisense optium blood glucose electrodes.
* Cân phân tích, máy ly tâm, lò vi sóng, máy lắc vontex, pipetman… Các thiết bị đều đảm bảo tiêu chuẩn về độ chính xác và an toàn.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết mẫu nghiên cứu.
Từ 3000g Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.) rửa sạch, sấy khô được ngâm chiết với ethanol 90%. Quá trình ngâm chiết được tiến hành lặp lại 3 lần. Phần nước lọc được lọc qua giấy lọc 3 lần để loại bỏ cặn thu được dịch chiết. sau đó dùng đèn 200W sấy làm bay hơi nước để thu lấy cao cồn , sau đó
30
mẫu lại tiếp tục đươc ngâm với n-hexan tiến hành tương tự thu được cao n- hexan, tiếp tục ngâm với ethylacetate thu được cao ethylacetate
2.2.2. Phƣơng pháp khảo sát thành phần hóa học của cây Vú sữa đất
(Euphorbia hirta L.)
2.2.2.1. Định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên
Cao các phân đoạn được hòa tan trong dung môi thích hợp với từng loại phản ứng định tính. Các nhóm phản ứng được trình bày tóm tắt trong bảng sau:
Bảng 2.1. Bảng các phản ứng định tính đặc trƣng
Nhóm hợp
chất Phản ứng Thuốc thử Dấu hiệu nhận biết
Flavonoid
Shinoda Mg/HCL
Màu đỏ, hồng, da cam xuất hiện chứng tỏ sự có mặt của flavon, flavonol và các dẫn xuất hydro của chúng.
Diazo hóa Diazo Phản ứng cho màu da cam là dương tính.
Dung dịch
kiềm NaOH10%
Phản ứng có kết quả dương tính khi xuất hiện màu vàng cam.
Acid sulfuric H2SO410%
Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của favon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron.
Vanilin/HCL Màu đỏ son xuất hiện chứng tỏ sự có mặt của catechin.
31
hiện màu đỏ đậm. Dung dịch 5%, Gelatin/1%
NaCL
Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết tủa.
Acetate chì 10% Phản ứng dương tính nếu kết tủa xuất hiện.
Alkaloid
Bouchardat Hỗn hợp KI+I2/HCL
Phản ứng dương tính nếu có màu đỏ thẫm
vansMayer Hỗn hợp HgCL2+ KI
Phản ứng dương tính nếu có kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt. Dragendorf Phản ứng dương tính nếu có kết
tủa màu da cam.
Glycoside Keller-Killian
Phản ứng dương tính nếu xuất hiện vòng đỏ nâu ở bề mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng.
Polyphenol khác
Dung dịch kiềm Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu vàng.
FeCL3/HCL Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu lục, xanh, đen.
2.2.2.2. Định lƣợng pholyphenol tổng số theo phƣơng pháp Folin Ciocalteau
Nguyên tắc: dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol (trong mẫu) với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam. So màu trên máy quang phổ UV VIS 1000 ở bước sóng λ = 765 nm, dùng chất chuẩn là acid gallic [35].
Các bước tiến hành như sau:
32
Dung dịch acid gallic; 0.5 g acid gallic + 10ml C2H5OH + 90ml H2O bảo quản lạnh. Như vậy dịch chuẩn gốc aid gallic có nồng độ 5mg/ml.
Dung dịch Na2CO3; 200g Na2CO3 + 800ml H2O đun sôi. Thêm một vài giọt tinh thể Na2CO3, sau 24 giờ đem lọc và dẫn nước cất tới 1000ml.
Dung dịch mẫu cần định lượng.
* Tiến hành xây dựng đường chuẩn acid gallic.
Chuẩn bị cốc định lượng theo số lượng dung dịch gốc như sau: 0,1, 2, 3, 5 và 10ml sau đó dẫn nước cất tới 100ml ta thu được các nồng độ 0, 50, 100, 150, 250, và 500mg/l acid gallic.
Cho vào mỗi cuvert 20 µl mẫu thử (dung dịch gallic chuẩn ở các nồng độ hoặc dịch chiết các phân đoạn ) + 1.58 ml H2O + 100µl thuốc thử Folin- Ciocalteau sau 30 giây đến 8 phút cho thêm 300 µl Na2CO3. Để hỗn hợp dunh dịch phản ứng trong hai giờ ở 200c rồi xác định ở bước sóng 765 nm. Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn.
Định lượng phenolic của mẫu nghiên cứu bằng cách lấy 20 µl để định lượng tương tự như đã làm với mẫu chuẩn aicd gallic.
2.2.3. Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết các phân đoạn cây Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.) lên trọng lƣợng và một số chỉ số hóa sinh máu của chuột BP thực nghiệm
2.2.3.1. Thử độc tính cấp, xác định LD50
Xác định LD50 của dịch chiết cây Vũ sữa đất theo phương pháp Lorke [17]. Chuột nhịn đói trước 16 giờ thí nghiệm được phân lô ngẫu nhiên N=10 và cho uống theo liều tăng dần cho đến 8g/kg (thể tích và khối lượng tối đa cho ph p ). Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết cây Vú sữa đất .
33
2.2.3.2. Xây dựng mô h nh chuột BP thực nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, sau khi mua về chuột được chăm sóc bình thường trong 3-4 ngày để thích ứng với môi trường mới sau đó tiến hành phân chuột thành 2 nhóm với hai chế độ dinh dưỡng như sau:
Nhóm 1 - Nhóm đối chứng: Các con chuột tiếp tục được chăm sóc bằng thức ăn bình thường (do viện Vệ sinh Dịch tễ cung cấp).
Nhóm 2 - Nhóm nuôi béo: Các con chuột được chăm sóc bằng chế độ thức ăn giàu lipid và cholesterol.
Các nhóm chuột được theo dõi trong vòng 8 tuần, trọng lượng của các con chuột được kiểm tra hàng tuần. Vào tuần cuối cùng thời gian thí nghiệm, sau khi xác định trọng lượng, chúng tôi tiến hành lựa chọn ngẫu nhiên từ mỗi nhóm ra 10 con chuột, lấy máu tổng số và phân tích một số chỉ số lipid máu. Các số liệu được thu thập và tiến hành xử lý thống kê.
2.2.4. Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Aflolien60 F245 (Merck) RP18F245 (Merck) bằng hệ dung môi Toluen:Ethylaxetat:Aceton:Acid Formic(TEAF) 5:3:1:1. Dùng chất hiện màu là H2SO4 10%,sấy kho trên bếp điện từ đến khi hiện màu.
2.2.5. Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết của dịch chiết cây Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.) lên chuột nhắt gây ĐTĐ ằng STZ
Để tìm hiểu tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết cây Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.), trước tiên chúng tôi tiến hành gây mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2 dựa trên chế độ ăn giàu chất b o kết hợp với STZ liều đơn của Srinivasan.
2.2.5.1. Phƣơng pháp gây ĐTĐ thực nghiệm mô phỏng type 2
Chuột nuôi BP được gây ĐTĐ type 2 bằng tiêm STZ (110mg/kg pha trong đệm citrate 0.01M, pH = 4.3) dưới màng bụng, gây rối loạn trao đổi glucose máu của chuột BP thực nghiệm nhằm tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2
34
phát triển từ BP. Trước khi thí nghiệm cho chuột nhịn đói 16h. Sau đó chúng được uống nước và ăn bình thường. Sau từ 3- 4 ngày những con chuột này bị bệnh với nồng độ glucose huyết được xác định ≥ 18mmol/l [9], [11]. Tiến hành phân các lô chuột (mỗi lô gồm 5 con) đã bị bệnh để nghiên cứu khả năng hạ đường huyết khi sử dụng các phân đoạn dịch chiết từ Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.).
Lô 1: Lô STZ nhóm đối chứng không điều trị Lô 2: Lô STZ điều trị bằng phân đoạn EtOH Lô 3: Lô STZ điều trị bằng phân đoạn n-hexan Lô 4: Lô STZ điều trị bằng phân đoạn EtOAc
Chuột bị bệnh uống điều trị các phân đoạn dịch chiết từ Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.), được tiến hành đo nồng độ glucose huyết của chuột ở các thời điểm khác nhau (2h, 4h, 8h, 10h) và tiến hành các x t nghiệm tiếp theo. Sau đó tiếp tục điều trị cho chuột trong vòng 21 ngày (3 tuần).
2.2.5.2. Thử khả n ng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết từ
cây Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.)trên mô h nh chuột ĐTĐ type 2
Các lô chuột ĐTĐ type 2 (5 con/lô) được ăn thức ăn thường và điều trị hằng ngày bằng cách cho uống phân đoạn dịch chiết từ cây Vú sữa đất (Euphorbia hirta L.) với liều 2000mg/kg. Đường huyết của các con chuột được đo vào cùng một thời điểm trong ngày và sau khi nhịn đói 12 giờ ở các ngày thứ 0 (trước khi điều trị), ngày thứ 5, 10, 15, 21 khi điều trị.
35
Bảng 2.3. Mô hình nghiên cứu khả n ng hạ glucose của các phân đoạn