a. Hệ thống GC-MS
- Hệ thống GC: Agilent Technologies 7890A. - Hệ thống MS: Agilent Technologies 5975C. - Cột sắc kí: HP-5MS
+ Chiều dài cột: 30cm + Đường kính cột: 0,25mm
b. Chương trình khai triển
Tinh dầu thân rễ Ngải tiên được pha loãng bằng Cloroform (MECRK) đến nồng độ 10-2 rồi cho vào lọ thủy tinh 2ml, đậy nắp chuyên dụng, lắc đều, đặt vào khay chứa mẫu của hệ thống tiêm mẫu tự động. Tiêm mẫu tự động. Thể tích tiêm mẫu: 1µl, chia dòng 1:50. Sử dụng khí mang Heli, tốc độ khí mang: 1ml/phút. Chương trình nhiệt độ:
Bảng 3.2: Chương trình nhiệt độ của hệ thống GC-MS
Thời gian (phút) Nhiệt độ (°C)
Cột
0-2 50
2-27 50-100
27-33,7 100-200
33,7-35,7 200
Nhiệt độ hóa hơi mẫu 250
Detector: Khối phổ (MS) Aligent Technologies 5975C
c. Kết quả
Phổ GC-MS được so sánh với thư viện phổ Willey, Flavor và Nist để phân tích kết quả. Hàm lượng phần trăm tương đối của các thành phần được tính dự vào diện tích pic.
Bảng 3.3: Thành phần và hàm lượng các chất trong tinh dầu thân rễ Ngải tiên STT Tên chất Thời gian lưu (phút) Diện tích Pic Hàm lượng (%) 1 α –Thujen 8,447 1947606 0,262 2 α –Pinen 8,717 45924867 6,184 3 Camphen 9,372 3069936 0,413 4 Sabinen 10,616 7138946 0,961 5 ß –Pinen 10,725 168363778 22,671 6 ß –Myrcen 11,601 6523434 0,878 7 Phellandren 12,213 9537142 1,248 8 3-Caren 12,523 2502720 0,337 9 α –Terpinen 12,900 1968601 0,265 10 o,p-Cymen 13,355 17044444 2,295 11 Limonen 13,577 31659304 4,263 12 1,8-Cineol 13,691 300701284 40,491 13 γ-Terpinen 15,382 7935689 1,069 14 α –Terpinolen 17,169 3299610 0,444 15 Linalool 18,018 3645854 0,491 16 Borneol 22,004 9757740 1,314 17 4-Terpineol 22,804 32607466 4,391 18 Terpineol 23,715 72369287 9,745 19 α –Terpinolen 30,428 5540300 0,746 20 Caryophyllen 31,588 2918656 0,393 21 Caryophyllen oxid 33,543 2851220 0,384 22 Spathulenol 33,948 1284150 0,173 23 4-Isobutylidene-2,2- dimethyl-8-oxa bicycle [3.2.1] oct-6-en-3-on 34,006 1545364 0,208 24 Longifolenaldehyd 34,459 2507968 0,338 Tổng = 742645366 100%
Nhận xét: Kết quả GC-MS cho thấy trong tinh dầu Thân rễ Ngải tiên có 10 thành phần chính là: α–pinen (6,18%), sabinen (0,961%), ß–pinen (22,671%), cymen (2,295%), limonen (4,263%), 1,8-cineol (40,491%), borneol (1,314%), ß– myrcen (0,878%), 4-terpineol (4,391%), terpineol (9,745%). Trong đó, hàm lượng 1,8-cineol và ß-pinen rất cao. Ta đối chiếu với sắc ký đồ sau khi phun thuốc hiện màu có 10 vết hiện màu rõ rệt, được phân tích bởi phần mềm VideoScan (độ nhạy 25pixels, hmin=30, Smin=300) tương ứng với 10 Pic. Điều đó chứng tỏ SKLM kết hợp xử lý bằng WinCat và VideoScan là phương pháp đơn giản nhưng tương đối chính xác.
BÀN LUẬN
Cây Ngải tiên được người dân sử dụng chữa 1 số bệnh thông thường như: đau bụng lạnh, khó tiêu, phong thấp, rắn cắn…Ở nước ta cũng như trên thế giới, ngoài những công dụng đó người ta còn đi sâu vào nghiên cứu tác dụng chống ung thư của các Diterpen phân lập từ thân rễ cho nhiều kết quả khả quan. Cây phát triển tương đối tốt khi được trồng trọt để lấy hoa làm cảnh ở 1 số địa phương. Tuy có nhiều tác dụng tốt và tiềm năng phát triển lớn nhưng hiện nay cây mới chỉ được dùng theo kinh nghiệm dân gian mà chưa phát huy được hết giá trị sử dụng. Vì vậy, việc tiến hành nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học của cây là rất cần thiết, những kết quả đạt được sẽ là cơ sở dữ liệu để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho cây Ngải tiên khi được sử dụng trên quy mô lớn.
Về phương pháp nghiên cứu: Ngoài những phương pháp thướng qui nghiên cứu về thực vật, hóa học như vi học, định tính phản ứng hóa học, SKLM thì việc kết hợp các phương pháp hiện đại vào nghiên cứu dược liệu nói chung và Ngải tiên nói riêng là rất hữu ích. Các phân tích sắc ký đồ của phần mềm WinCats và Video Scan vừa chính xác lại vừa tiện lợi khi cho ta luôn kết quả số vết, Rf, Spic từng vết mà không phải làm thử công. Phương pháp GC-MS lại giúp chúng ta định tính và định lượng các thành phần dễ bay hơi, trong đó có tinh dầu. Việc này giúp chúng ta nghiên cứu chuyên sâu hơn và có đánh giá chính xác hơn.
Về đặc điểm thực vật, đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm hình thái cây, đặc điểm vi phẫu, đặc điểm vi học bột lá và thân rễ Ngải tiên. Đây là lần đầu tiên các đặc điểm thực vật của cây được nghiên cứu 1 cách đầy đủ, trong khi các nghiên cứu trước đó chỉ dừng lại ở mô tả hình thái cây, phân tích hoa đồ.
Về hóa học, đã tiến hành kiểm nghiệm bột thân rễ của cây bằng các phản ứng hóa học đặc trưng. Tiến hành dò tìm hệ dung môi chạy sắc ký cho dịch chiết MeOH, dịch chiết thủy phân, tinh dầu và kết hợp xử lý bằng phần mềm chuyên dụng cho kết quả nhanh, chính xác.
Về nghiên cứu tinh dầu, đã tiến hành xác định thành phần hóa học, hàm lượng tinh dầu trong thân rễ Ngải tiên bằng GC-MS cho kết quả rất chi tiết. Trong
các thành phần chính của tinh dầu có 1,8-cineol có hàm lượng lên tới 40,491% có nhiều tác dụng rất quý và có giá trị kinh tế, bởi vậy Ngải tiên cũng có thể là 1 nguồn để cung cấp 1,8-cineol đáng quan tâm.
Những kết quả đạt được sẽ là cơ sở dữ liệu khoa học về cây Ngải tiên phục
vụ đề tài “NGHIÊN CỨU BẢO TỒN VÀ PHÁT TRIỂN MỘT SỐ NGUỒN
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Về thực vật: Khóa luận đã xác định và chụp ảnh được các đặc điểm hình thái cây: lá, quả, hạt, thân rễ.Vi phẫu: Lá, thân rễ của cây Ngải tiên. Đặc điểm vi học: Bột lá (biểu bì chứa lỗ khí, mô mềm, mảnh mạch, mảnh phiến lá…), bột thân rễ (mảnh mạch, bó sợi, hạt tinh bột, mảnh mang màu,mảnh bần, mô mềm mang tinh bột). Về hóa học: Qua các thí nghiệm định tính hóa học, khóa luận đã xác định được trong thân rễ Ngải tiên có chứa: polysarcarid, flavonoid, saponin, tinh dầu, acid amin, acid hữu cơ, sterol, polysaccarid, đường khử. Ngoài ra cũng đã xác định được hệ dung môi chạy SKLM: Toluen-Ethyl acetat-A.formic (5,5:4,5:0,5) cho dịch chiết MeOH toàn phần, chụp và xử lý hình ảnh bằng các phần mềm winCATS, VideoScan góp phần làm cơ sở dữ liệu hóa học của cây.
Về nghiên cứu tinh dầu: Đề tài đã xác định được hàm lượng tinh dầu trong mẫu thân rễ là 0,365% tính theo dược liệu khô tuyệt đối. Đã tiến hành chạy SKLM, GC- MS xác định được thành phần hóa học, hàm lượng các chất trong tinh dầu thân rễ. Gồm các thành phần chính: α–pinen (6,18%), sabinen (0,961%), ß–pinen (22,671%), cymen (2,295%), limonen (4,263%), 1,8-cineol (40,491%), borneol (1,314%), ß–myrcen (0,878%), 4-terpineol (4,391%), terpineol (9,745%).
Kiến nghị
Ngải tiên là cây dược liệu đang còn tương đối mới, chưa được nghiên cứu 1 cách đầy đủ và chuyên sâu. Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, người ta quan tâm chủ yếu tới tác dụng chống ung thư của các Diterpen trong thân rễ. Vì vậy, ngoài kết quả nghiên cứu của đề tài cũng như những nghiên cứu đã công bố trước đó, chúng tôi đề xuất nghiên cứu thêm thành phần hóa học tinh dầu hoa, lá của cây Ngải tiên cũng như tác dụng sinh học của chúng và của tinh dầu thân rễ. Nghiên cứu đưa Ngải tiên vào trồng trọt quy mô lớn để khai thác hết tiềm năng của cây.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Bộ môn Dược liệu (1998), Bài giảng dược liệu Tập I, II, Trường đại học Dược Hà Nội.
2. Bộ môn Dược liệu (1999), Thực tập dược liệu - Phần hóa học, Phần vi học,
Trường Đại học Dược Hà Nội.
3. Bộ môn Thực vật (2005), Thực vật học. Trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 347 - 348.
4. Bộ Y tế, Dược điển Việt Nam IV, Phụ lục 9.8.
5. Đỗ Huy Bích và CS (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam tập I, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr. 141-143.
6. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr. 821.
7. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, NXB Y học.
8. Đỗ Thị Hiền (2012), Góp phần nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thân rễ cây Ngải tiên Bousigon (Hedychium Bousigonianum Pierre ex Gagn), Luận văn thạc sĩ chuyên nghành hóa hữu cơ, Đại học Khoa học Tự nhiên.
9. Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam tập III, NXB Trẻ, tr. 451.
10.Văn Ngọc Hướng và CS (2012), Góp phần nghiên cứu các hợp chất labdan diterpen có hoạt tính gây độc tế bào ung thư của thân rễ cây Ngải tiên (Hedychium coronarium Koenig), Tạp chí Dược học, Tháng 1-2012.
11.Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học, tr. 400-410.
12.Nguyễn Thị Mai Phương (2011), Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây Ngải tiên (Hedychium coronarium Koenig), Luận văn thạc sĩ chuyên nghành hóa hữu cơ, Đại học Khoa học Tự nhiên.
13.Nguyễn Viết Thân, Cây thuốc Việt Nam và những bài thuốc thường dùng tập II, Nhà xuất bản Thời đại, tr. 310.
14.Nguyễn Thị Kim Thúy (2013), Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây Ngải tiên Hedychium coronarium Koenig, Luận án Tiến sỹ hóa học, Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên.
15.Nguyễn Thị Thuỷ, và CS (2003), Thành phần hoá học của tinh dầu Ngải tiên (Hedychium coronarium Koenig), Viện Sinh thái & Tài nguyên Sinh vật, Viện KH& CNVN.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
16.Ajay Kumar Meena, et al (2010), Comparative Study on Family ZingiberaceaePlants Used In Ayurvedic Drugs, International Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 2(2), pp. 58-60.
17.Armen Takhtajan (2009), Flowering Plants, Springer, pp. 707.
18.Beena Joy, et al (2007), Antimicrobial activity andchemical composition of essential oil from Hedychium coronarium, Phytotherapy Research,Volume 21, Issue 5, pp. 439–443.
19.Flora of China, volume 24, pp. 270.
20.Hamidou F. Sakhanokho, et al (2013), Chemical Composition, Antifungal and Insecticidal Activities of HedychiumEssential Oils, Molecules, 18, pp. 4308-4327.
21.Hans Wohlmuth (2008), Phytochemistry and pharmacology of plants from the ginger family , Zingiberaceae, Southern Cross University.
22.Jiau-Ching Ho (2011), Antimicrobial, Mosquito Larvicidal and Antioxidant Properties of the Leaf and Rhizome of Hedychium coronarium, Journal of the Chinese Chemical Society, 58, pp. 563-567.
23.Kajaria Divya, et al, Study of Antiasthmatic Properties and Chemical Characterization of Indigenous Ayurvedic Compounds (Polyherbal Formulations), Medical Sciences, India.
24.Kh. Lemino Singh, et al (2013), Comparative Study Of Phytochemical Constituents And Total Phenolic Content In The Extracts Of Three Different
Species Of Genus Hedychium, International Journal of PharmTech Research, Vol.5, No.2, pp. 601-606.
25.M. A bdul A ziz, et al (2009), Antibacterial andCytotoxicActivitiesof Hedychium coronarium J.Koenig, Journal of Agriculture and Biological Sciences,5(6), pp. 969-972.
26.Muhammad Lateef, et al (2013), An Account of Botanical Anthelmintics and Methods Used for Their Evaluation,Veterinary and animal sciences, pp. 2305-7211.
27.Nitirat Chimnoi, et al (2008), Labdane diterpenes from the rhizomes of Hedychium coronarium, Natural Product Research: Formerly Natural Product Letters,Volume 22, Issue 14.
28.Phan Van Kiem, et al (2011), Chemical constituents of the rhizomes of Hedychium coronariumand their inhibitory effect on the pro-inflammatory cytokines production LPS-stimulated in bone marrow-derived dendritic cells”. Bioorganic &Medicinal Chemistry Letters, Volume 21, Issue 24, pp. 7460–7465.
29.Sadhana Sah, et al (2012), Phytochemical and Antimicrobial Assessment of Five Medicinal Plants Found in Terai Region, Nepal Journal of Science and Technology ,Vol 13, pp. 79-86.
30.Shivani Ghildiyal, et al (2012), Pharmacognostical Study of Hedychium Spicatum(Ham-Ex-Smith) Rhizome, Asian Pacific Journal of Tropical Disease, pp. 148-153.
31.Ruchadaporn Kaomongkolgit, et al (2012), Antifungal activity of coronarin D against Candida albicans, Oral Surgery Oral Medicine Oral Pathology and Oral Radiology Volume 114, issue 1.
32.Nuno Rainha, et al (2012), Anti-acetylcholinesterase and Antioxidant Activity of Essential Oils from Hedychium gardnerianum Sheppard ex Ker- Gawl, Molecules 2012,17, pp. 3082-3092.
33.Yuanjiang Pan, et al (2001), New diterpene from Hedychium villosum,
Fitoterapia, Volume 72, Issue 7, pp. 837–838.
TÀI LIỆU TIẾNG PHÁP
PHỤ LỤC
1. PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC