Cân khoảng 10g bột thân rễ Ngải tiên cho vào bình nón 100ml, thêm 50ml cồn 90°. Đun cách thủy 10 phút, lọc nóng lấy dịch lọc làm các phản ứng sau:
a. Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda)
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm một ít bột magnesi kim loại (khoảng 10mg). Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 - 5 giọt). Để yên một vài phút, nhận thấy dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu hồng Phản ứng dương tính.
b. Phản ứng với kiềm
Phản ứng với hơi amoniac: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô, rồi hơ trên miệng lọ có chứa amoniac đặc đã mở nút, đối chiếu với tờ giấy nhỏ giọt dịch chiết đối chứng thấy màu vàng của vết đậm lên rõ rệt Phản ứng dương tính.
Phản ứng với dd NaOH 10%: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%, thấy dịch chiết chuyển từ vàng sang vàng đậm, khi đun nóng thấy xuất hiện màu đỏ Phản ứng dương tính.
c. Phản ứng với FeCl3
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%.Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa xanh đen Phản ứng dương tính.
d. Phản ứng diazo hóa
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm dung dịch NaOH, thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều, đun nóng trên nồi cách thủy trong vài phút thấy xuất hiện màu đỏ Phản ứng dương tính.
Kết luận sơ bộ: Thân rễ Ngải tiên có chứa flavonoid.
3.2.2.2. Định tính coumarin.
Lấy khoảng 5g bột thân rễ Ngải tiên cho vào bình nón 100ml, thêm 50ml cồn 90°. Đun cách thủy 5 phút, lọc nóng qua bông. Dịch lọc thu được dùng làm các phản ứng sau:
a. Phản ứng mở đóng vòng lacton :
- Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết: Ống 1 thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10% Ống 2 để nguyên.
- Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi. Để nguội rồi quan sát không thấy hiện tượng gì
b. Phản ứng diazo hóa
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch NaOH, thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều, đun nóng trên nồi cách thủy trong vài phút thấy xuất hiện màu đỏ Phản ứng dương tính.
c. Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm.
Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy thấm. Nhỏ tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5%. Sấy nhẹ. Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng đồng xu rồi chiếu tia tử ngoại trong vài phút. Bỏ đồng xu ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại thấy phần không bị che có huỳnh quang sáng giống phần bị che Phản ứng âm tính.
d. Vi thăng hoa
Cho một ít bột thân rễ Ngải tiên vào nắp chai kim loại. Đặt lên bếp điện có lưới amian, cho bay hết hơi nước trong dược liệu. Đặt trên miệng nắp nhôm một phiến kính trên đó có đặt ít bông thấm nước lạnh. Đun nhẹ dưới nắp nhôm, sau 5 phút lấy lam kính ra, để nguội, soi dưới kính hiển vi không thấy tinh thể hình kim
Phản ứng âm tính.
Kết luận sơ bộ:Thân rễ Ngải tiên không chứa coumarin.
3.2.2.3. Định tính saponin.
a. Quan sát hiện tượng tạo bọt
Cho vào ống nghiệm lớn 0,1g bột thân rễ Ngải tiên, thêm 5ml nước. Lắc mạnh trong 5 phút. Để yên và quan sát thấy hiện tượng tạo bọt bền vững sau 15phút.
b. Hiện tượng phá huyết
Cho một giọt máu bò đã loại fibrin lên phiến kính, nhỏ thêm một giọt dịch chiết nước của thân rễ Ngải tiên. Quan sát hiện tượng phá huyết trên kính hiển vi.
c. Phản ứng phân biệt Saponin steroid và Saponin triterpenoid
Lấy 1g bột thân rễ Ngải tiên cho thêm 5ml cồn đun sôi cách thủy trong 15 phút. Lấy 2 ống nghiệm cỡ bằng nhau, cho vào ống thứ nhất 5ml HCl 0.1N (pH=1) và ống thứ hai 5ml NaOH 0.1N (pH=13). Cho thêm vào mỗi ống 2-3 giọt dung dịch
cồn chiết rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống trong 15s. Để yên nếu cột bọt trong 2 ống cao ngang nhau và bền như nhau thì sơ bộ xác định dược liệu có Saponin triterpenoid. Nếu ống kiềm có cột bọt cao hơn ống kia thì sơ bộ xác định là Saponin steroid.
Kết quả: Cột bọt trong 2 ống ngang nhau Dược liệu chứa saponin triterpenoid
Kết luận sơ bộ:Thân rễ Ngải tiên có chứa saponin triterpenoid.
3.2.2.4. Định tính alcaloid.
Cân 1g bột thân rễ Ngải tiên cho vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 15ml dung dịch acid sulfuric 1N. Đun đến sôi. Để nguội. Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100ml. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N (khoảng 8ml) đến pH = 9-10 (thử bằng giấy quỳ hoặc chỉ thị màu vạn năng). Chiết alcaloid base bằng cloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 5ml). Gộp các dịch chiết cloroform, loại nước bằng natrisulfat khan, sau đó dùng để làm phản ứng định tính.
Lấy một phần dịch chiết cloroform đã được chuẩn bị ở trên, đem lắc với acid sulfuric 1N hai lần, mỗi lần 5ml. Gộp các dịch chiết nước. Chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2-3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:
a. Ống 1: thuốc thử Mayer, không thấy xuất hiện tủa màu từ trắng đến vàng. b. Ống 2: thuốc thử Bouchardat, không thấy xuất hiện tủa màu từ nâu đến đỏ nâu. c. Ống 3: thuốc thử Dragendorff, không thấy xuất hiện tủa màu từ vàng cam đến đỏ.
Kết luận sơ bộ: Thân rễ Ngải tiên không chứa alcaloid.
3.2.2.5. Định tính tanin
Lấy khoảng 1,00g bột thân rễ Ngải tiên cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml nước cất, đun sôi trong 2 phút. Để nguội, lọc. Dịch lọc dùng để định tính. a. Ống 1: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% (TT) thấy xuất hiện kết tủa màu xanh nâu nhạt Phản ứng dương tính.
b. Ống 2: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10% (TT) thấy xuất hiện tủa bông
c. Ống 3: lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1% không thấy xuất hiện tủa bông trắng Phản ứng âm tính.
Kết quả: 2 phản ứng a, b dương tính. Phản ứng c âm tính. Kết luận sơ bộ: Thân rễ Ngải tiên không có tannin.
3.2.2.6. Định tính anthranoid.
a. Phản ứng Borntraeger
Định tính anthranoid toàn phần (dạng glycosid và dạng tự do)
Cho vào ống nghiệm lớn 1g thân rễ Ngải tiên. Thêm 5ml dung dịch acid sulfuric 1N. Đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi. Lọc dịch chiết còn nóng qua một lớp bông mỏng vào trong bình gạn dung tích 50ml. Làm nguội dịch lọc. Thêm 5ml chloroform, lắc nhẹ, gạn bỏ lớp nước. Giữ lớp cloroform để làm phản ứng.
Lấy 1ml dịch chiết cloroform, thêm 1ml dung dịch amoniac. Lắc nhẹ. Không thấy lớp nước xuất hiện màu đỏ sim Phản ứng âm tính.
Kết luận sơ bộ:Thân rễ Ngải tiên không có anthranoid.
3.2.2.7. Định tính glycosid tim.
Lấy 3g thân rễ Ngải tiên, chiết soxhlet với n-hexan 1 giờ. Bã dược liệu sấy khô, cho vào bình cầu, đun hồi lưu với ethanol 40% trong 1 giờ. Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ, thêm khoảng 3ml chì acetat 30%, khuấy đều. Lọc loại tủa, thử dịch lọc vẫn còn tủa với chì acetat, cho thêm 1ml chì acetat nữa vào dịch chiết, khuấy và lọc lại. Tiếp tục thử đến khi dịch chiết không còn tủa với chì acetat. Cho toàn bộ dịch lọc vào bình gạn và lắc kỹ với hỗn hợp chloroform:ethanol tỷ lệ 4:1 (3 lần, mỗi lần 5ml), gạn lấy lớp chloroform vào cốc có mỏ khô sạch. Chia dịch chiết vào 6 ống nghiệm nhỏ, bốc hơi dung môi trên nồi cách thuỷ cho đến khô. Cắn còn lại để làm các phản ứng định tính sau:
a. Phản ứng của khung steroid: Phản ứng Liebermann
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Nhận thấy mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất
hiện một vòng màu tím đỏ. Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên có màu xanh lá Phản ứng dương tính.
b. Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh
- Phản ứng Baljet
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet (1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%) mới pha. Không thấy xuất hiện màu đỏ da cam
Phản ứng âm tính. - Phản ứng Legal
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ 1 giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đều. Phản ứng thấy xuất hiện màu đỏ cam Phản ứng âm tính.
c. Phản ứng của phần đường 2,6 - desoxy: Phản ứng Keller - Kiliani
Cho vào ống nghiệm chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic. Lắc đều. Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulphuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện 1 vòng màu tím đỏ. Lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá Phản ứng dương tính.
Kết quả: Chỉ có phản ứng a và c dương tính.
Kết luận sơ bộ: Thân rễ Ngải tiên không có glycosid tim.