- Cất tinh dầu thân rễ Ngải tiên theo phương pháp cất kéo hơi nước bằng bộ dụng cụ cất tinh dầu cải tiến (Hình 2.1, trang 16) [2].
Hình 2.1: Cấu tạo bộ dụng cụ cất tinh dầu cải tiến [2]
A. Bình chứa dược liệu B. Bộ phận treo ống hứng tinh dầu
C. Ống sinh hàn
- Xác định độ ẩm thân rễ tươi bằng máy đo độ ẩm Sartorious, nguyên tắc đo theo công thức:
a = 100% × (mtươi -mkhô)/mtươi
Trong đó: a: hàm ẩm dược liệu tươi mtươi: Khối lượng thân rễ tươi
mkhô: Khối lượng thân rễ khô tuyệt đối
- Xác định hàm lượng tinh dầu thân rễ Ngải tiên theo dược liệu khô tuyệt đối.
Công thức tính: XTd% = Vtd/ (mtươi- mtươi× a) × 100%
Trong đó: XTd%: hàm lượng phần trăm tinh dầu thân rễ Mtươi: khối lượng dược liệu tươi (g)
a: Độ ẩm dược liệu tươi. - Sắc ký bản mỏng tinh dầu.
- Tiến hành sắc ký khí khối phổ (GC-MS) để xác định thành phần hóa học tinh dầu thân rễ Ngải tiên.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. Nghiên cứu về mặt thực vật
3.1.1. Mô tả hình thái cây
Hình 3.1: Đặc điểm một số bộ phận cây Ngải tiên
1.Ảnh cây 2.Cụm lá bắc 3.Quả 4.Hạt 5.Thân rễ 1 2 3 4 5
3.1.1. Đặc điểm hình thái cây và giám định tên khoa học
Đặc điểm hình thái mẫu thu hái: Cây thân thảo cao 1-2m giống cây gừng (1). Lá không cuống (1), hình dải mũi mác, nhẵn ở mặt trên, có lông dễ rụng ở mặt dưới, dài tới 20-45cm, rộng 12cm, thon dài. Lưỡi nhỏ ôm lấy thân giả. Cụm hoa hình trứng, dạng nón, lá bắc hẹp, lợp lên nhau (2). Quả nang (3), nứt 3 mảnh, bên trong có nhiều hạt màu đỏ (4). Thân rễ phát triển, dạng củ giống gừng (5).
Giám định tên khoa học:Tiến hành đối chiếu các đặc điểm mẫu nghiên cứu với các thông tin được ghi chép trong Cây cỏ Việt Nam [9], Thực vật chí Đông dương [34], Thực vật chí Trung Quốc [19], cây đã được TS. Nguyễn Quốc Huy (Bộ môn Thưc Vật, Đại học Dược Hà Nội) giám định tên khoa học là Hedychium coronarium
Koenig (Phụ lục 1).
3.1.2. Nghiên cứu vi học vi phẫu dược liệu
* Tiến hành:
- Tiến hành làm riêng vi phẫu gân lá, thân rễ riêng, cắt bằng dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay, chọn các lát cắt mỏng. Tẩy lát cắt dược liệu bằng cloramin B bão hòa tới khi lát cắt trắng hoàn toàn để tẩy sạch các chất trong tế bào, chỉ giữ lại màng tế bào nhằm quan sát tiêu bản dễ hơn. Rửa sạch bằng nước cất nhiều lần. Ngâm trong dung dịch acid acetic 5% để tấy clorid của cloramin B. Nhuộm xanh methylen (đã pha loãng theo tỷ lệ 1:4) trong vòng 15 phút. Rửa sạch nhiều lần bằng nước cất. Nhuộm đỏ son phèn trong 5 phút. Rửa sạch nhiều lần bằng nước cất. Đặt vi phẫu vào một giọt glycerin trên phiến kính,đậy lamen, soi trên kính hiển vi. Chụp ảnh các vi phẫu bằng máy Canon IXUS 115 ở vật kính 10x của kính hiển vi.
* Kết quả
- Đặc điểm vi phẫu của lá Ngải tiên:
Quan sát dưới kính hiển vi (Hình 3.2), ta thấy các đặc điểm sau:
Phần gân lá: Mặt trên hơi lõm, mặt dưới lồi. Biểu bì trên và dưới gồm các tế bào tròn, nhỏ, xếp đều đặn (1). Sát lớp biểu bì trên và dưới là mô mềm gồm các tế bào hình tròn hoặc đa giác có thành tế bào mỏng (2). Có nhiều bó libe-gỗ xếp đều đặn thành nhiều vòng cung hướng về phía gân chính, gỗ ở trên (3), libe ở dưới (4).
Vòng mô cứng ôm lấy libe (6). Bó libe-gỗ ở giữa, hàng cuối từ trên xuống lớn nhất và nhỏ dần về 2 phía. Xen kẽ các bó libe-gỗ hàng thứ 3 là các mô khuyết (5). Rải rác trong mô mềm có các tế bào tiết tinh dầu (8).
Phần phiến lá: Biều bì trên và dưới gồm 1 lớp tế bào hình chữ nhật, nhỏ, xếp đều đặn (7). Cả 2 mặt đều có lỗ khí. Giữa 2 biểu bì trên, dưới là mô mềm gồm các tế bào hình tròn hoặc đa giác không đều nhau (2). Rải rác trong mô mềm có các bó libe-gỗ, gỗ ở trên, libe ở dưới, vòng mô cứng dưới libe. Ngoài ra còn có các tế bào tiết tinh dầu (8).
- Đặc điểm vi phẫu của thân rễ Ngải tiên:
Quan sát dưới kính hiển vi (Hình 3.3), ta thấy các đặc điểm sau:
Vi phẫu cắt ngang thân rễ Ngải tiên thường có hình tròn. Ngoài cùng là lớp bần gồm 10-12 lớp tế bào. 6 lớp tế bào bên ngoài là các tế bào hình đa giác, 6 lớp bên trong là các tế bào hình chữ nhật xếp thành các dãy xuyên tâm (1). Sát lớp bần là mô mềm vỏ, gồm các tế bào hình tròn hoặc đa giác, thành tế bào mỏng (2). Rải rác trong mô mềm vỏ có các tế bào tiết tinh dầu (3). Phía trong xuất hiện nhiều mô khuyết (4). Tiếp theo là nội bì gồm 1 lớp tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn (5). Sát lớp nội bì có nhiều bó libe-gỗ nằm trong mô mềm ruột (6, 7). Mô mềm ruột cấu tạo từ các tế bào hình tròn hoặc đa giác (8), to hơn tế bào mô mềm vỏ, xen lẫn có các tế bào tiết tinh dầu, các mạch (9).
Hình 3.2: Vi phẫu lá Ngải tiên 1.Biểu bì gân lá 5.Mô khuyết 2.Mô mềm 6.Vòng mô cứng 3.Gỗ 7.Biểu bì phiến lá 4.Libe 8.Tế bào tiết tinh dầu
Hình 3.3. Vi phẫu thân rễ Ngải tiên 1.Bần 6.Libe
2.Mô mềm vỏ 7.Gỗ
3.Tế bào tiết 8.Mô mềm ruột 4.Mô khuyết 9.Mạch
3.1.3. Nghiên cứu vi học bột dược liệu
* Tiến hành
Sấy khô lá, thân rễ Ngải tiên trong tủ sấy ở 600C sau đó dùng thuyền tán nghiền nhỏ. Rây lấy bột mịn, dùng kim mũi mác lấy bột dược liệu cho lên phiến kính đã nhỏ sẵn nước cất, đậy lamen lên và quan sát dưới kính hiển vi. Xác định những đặc điểm vi học của bột lá, bột thân rễ Ngải tiên và chụp lại bằng máy ảnh.
* Kết quả:
- Đặc điểm vi học bột lá Ngải tiên:
Bột có màu xanh, mùi thơm, vị cay. Quan sát dưới kính hiển vi (Hình 3.4, trang 22) thấy có một số đặc điểm: Có các mảnh mô mềm gồm các tế bào hình tròn hoặc đa giác thành mỏng xếp sít nhau (1), có nhiều mảnh biểu bì mang lỗ khí (2), các mảnh phiến lá (3). Rải rác có các mảnh mạch (4,5), bó sợi (6).
- Đặc điểm vi học bột thân rễ Ngải tiên:
Bột có màu vàng nhạt, mùi thơm, vị cay. Quan sát dưới kính hiển vi (Hình 3.5, trang 22) thấy có một số đặc điểm: Rải rác có các mảnh mang màu (1). Mảnh bần với các tế bào xếp thành các dãy xuyên tâm (2). Hạt tinh bột hình trứng hoặc hình chuông, có các vân đồng tâm, không rõ. đứng riêng rẽ (6) hoặc thành đám (3), đường kính 0,04-0,07mm. Ngoài ra còn có các mảnh mạch (4), (5).
Nhận xét: Bột lá Ngải tiên không có đặc điểm đặc trưng để nhận biết so với các bột lá khác. Trong khi đó, bột thân rễ có một số đặc điểm đặc trưng như có nhiều mảnh bần gồm nhiều lớp tế bào hình đa giác, xếp thành các hàng xuyên tâm. Có các hạt tinh bột hình trứng hoặc hình chuông, kích thước 0,04-0,07mm, vân đồng tâm không rõ nét.
Hình 3.4: Một số đặc điểm bột lá Ngải tiên
1. Mảnh mô mềm 2. Biểu bì mang lỗ khí 3. Mảnh phiến lá 4,5. Mảnh mạch 6. Bó sợi
Hình 3.5: Một số đặc điểm bột thân rễ Ngải tiên
1. Mảnh mang màu 2. Mảnh bần 3. Đám tinh bột
3.2. Nghiên cứu về hóa học 3.2.1. Cất tinh dầu 3.2.1. Cất tinh dầu
3.2.1.1. Xác định độ ẩm thân rễ tươi
Cắt nhỏ thân rễ Ngải tiên tươi đã loại bỏ tạp, rửa sạch, lau khô. Sau đó cân chính xác 1g dược liệu tươi và cho vào cối sứ nghiền nhỏ. Đưa vào máy xác định độ ẩm dược liệu.
Kết quả: Độ ẩm thân rễ NGait tiên tươi: a= 82,48% .
3.2.1.2. Xác định hàm lượng tinh dầu các bộ phận Ngải tiên
Phương pháp cất tinh dầu: Cất kéo bằng hơi nước.
Dụng cụ: Sử dụng bộ dụng cụ cất tinh dầu cải tiến, Bộ môn dược liệu, Đại học Dược Hà Nội (Hình 2.1) [2].
Tiến hành:
- Thái nhỏ thân rễ tươi đã làm sạch tạp. Sau đó nghiền nát bằng thuyền tán. - Cân dược liệu thân rễ tươi mtươi = 469,82g.
- Cho dược liệu vào bình cất tinh dầu, đổ nước vừa ngập mặt dược liệu. Lắp bộ dụng cụ đúng quy định.
- Cất trong vòng 4 tiếng (tốc độ cất 2-3ml/phút). Sau đó ngừng cất, sau 15 phút đọc thể tích tinh dầu ở phần chia vạch của dụng cụ hứng tinh dầu.
- Rút lấy tinh dầu vào lọ thủy tinh có nắp Silicon.
Kết quả: Vtinh dầu = 0,3ml
Áp dụng công thức (Trang 16): XTd% = 0,365%
Trong đó: XTd%: hàm lượng phần trăm tinh dầu trong thân rễ mtươi=469,82 g
a=82,48%
3.2.2. Định tính các nhóm chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học.
3.2.2.1. Định tính flavonoid.
Cân khoảng 10g bột thân rễ Ngải tiên cho vào bình nón 100ml, thêm 50ml cồn 90°. Đun cách thủy 10 phút, lọc nóng lấy dịch lọc làm các phản ứng sau:
a. Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda)
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm một ít bột magnesi kim loại (khoảng 10mg). Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 - 5 giọt). Để yên một vài phút, nhận thấy dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu hồng Phản ứng dương tính.
b. Phản ứng với kiềm
Phản ứng với hơi amoniac: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô, rồi hơ trên miệng lọ có chứa amoniac đặc đã mở nút, đối chiếu với tờ giấy nhỏ giọt dịch chiết đối chứng thấy màu vàng của vết đậm lên rõ rệt Phản ứng dương tính.
Phản ứng với dd NaOH 10%: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%, thấy dịch chiết chuyển từ vàng sang vàng đậm, khi đun nóng thấy xuất hiện màu đỏ Phản ứng dương tính.
c. Phản ứng với FeCl3
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%.Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa xanh đen Phản ứng dương tính.
d. Phản ứng diazo hóa
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm dung dịch NaOH, thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều, đun nóng trên nồi cách thủy trong vài phút thấy xuất hiện màu đỏ Phản ứng dương tính.
Kết luận sơ bộ: Thân rễ Ngải tiên có chứa flavonoid.
3.2.2.2. Định tính coumarin.
Lấy khoảng 5g bột thân rễ Ngải tiên cho vào bình nón 100ml, thêm 50ml cồn 90°. Đun cách thủy 5 phút, lọc nóng qua bông. Dịch lọc thu được dùng làm các phản ứng sau:
a. Phản ứng mở đóng vòng lacton :
- Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết: Ống 1 thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10% Ống 2 để nguyên.
- Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi. Để nguội rồi quan sát không thấy hiện tượng gì
b. Phản ứng diazo hóa
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch NaOH, thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều, đun nóng trên nồi cách thủy trong vài phút thấy xuất hiện màu đỏ Phản ứng dương tính.
c. Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm.
Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy thấm. Nhỏ tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5%. Sấy nhẹ. Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng đồng xu rồi chiếu tia tử ngoại trong vài phút. Bỏ đồng xu ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại thấy phần không bị che có huỳnh quang sáng giống phần bị che Phản ứng âm tính.
d. Vi thăng hoa
Cho một ít bột thân rễ Ngải tiên vào nắp chai kim loại. Đặt lên bếp điện có lưới amian, cho bay hết hơi nước trong dược liệu. Đặt trên miệng nắp nhôm một phiến kính trên đó có đặt ít bông thấm nước lạnh. Đun nhẹ dưới nắp nhôm, sau 5 phút lấy lam kính ra, để nguội, soi dưới kính hiển vi không thấy tinh thể hình kim
Phản ứng âm tính.
Kết luận sơ bộ:Thân rễ Ngải tiên không chứa coumarin.
3.2.2.3. Định tính saponin.
a. Quan sát hiện tượng tạo bọt
Cho vào ống nghiệm lớn 0,1g bột thân rễ Ngải tiên, thêm 5ml nước. Lắc mạnh trong 5 phút. Để yên và quan sát thấy hiện tượng tạo bọt bền vững sau 15phút.
b. Hiện tượng phá huyết
Cho một giọt máu bò đã loại fibrin lên phiến kính, nhỏ thêm một giọt dịch chiết nước của thân rễ Ngải tiên. Quan sát hiện tượng phá huyết trên kính hiển vi.
c. Phản ứng phân biệt Saponin steroid và Saponin triterpenoid
Lấy 1g bột thân rễ Ngải tiên cho thêm 5ml cồn đun sôi cách thủy trong 15 phút. Lấy 2 ống nghiệm cỡ bằng nhau, cho vào ống thứ nhất 5ml HCl 0.1N (pH=1) và ống thứ hai 5ml NaOH 0.1N (pH=13). Cho thêm vào mỗi ống 2-3 giọt dung dịch
cồn chiết rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống trong 15s. Để yên nếu cột bọt trong 2 ống cao ngang nhau và bền như nhau thì sơ bộ xác định dược liệu có Saponin triterpenoid. Nếu ống kiềm có cột bọt cao hơn ống kia thì sơ bộ xác định là Saponin steroid.
Kết quả: Cột bọt trong 2 ống ngang nhau Dược liệu chứa saponin triterpenoid
Kết luận sơ bộ:Thân rễ Ngải tiên có chứa saponin triterpenoid.
3.2.2.4. Định tính alcaloid.
Cân 1g bột thân rễ Ngải tiên cho vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 15ml dung dịch acid sulfuric 1N. Đun đến sôi. Để nguội. Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100ml. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N (khoảng 8ml) đến pH = 9-10 (thử bằng giấy quỳ hoặc chỉ thị màu vạn năng). Chiết alcaloid base bằng cloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 5ml). Gộp các dịch chiết cloroform, loại nước bằng natrisulfat khan, sau đó dùng để làm phản ứng định tính.
Lấy một phần dịch chiết cloroform đã được chuẩn bị ở trên, đem lắc với acid sulfuric 1N hai lần, mỗi lần 5ml. Gộp các dịch chiết nước. Chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2-3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:
a. Ống 1: thuốc thử Mayer, không thấy xuất hiện tủa màu từ trắng đến vàng. b. Ống 2: thuốc thử Bouchardat, không thấy xuất hiện tủa màu từ nâu đến đỏ nâu. c. Ống 3: thuốc thử Dragendorff, không thấy xuất hiện tủa màu từ vàng cam đến đỏ.
Kết luận sơ bộ: Thân rễ Ngải tiên không chứa alcaloid.
3.2.2.5. Định tính tanin
Lấy khoảng 1,00g bột thân rễ Ngải tiên cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml nước cất, đun sôi trong 2 phút. Để nguội, lọc. Dịch lọc dùng để định tính. a. Ống 1: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% (TT) thấy xuất hiện kết tủa màu xanh nâu nhạt Phản ứng dương tính.
b. Ống 2: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10% (TT) thấy xuất hiện tủa bông
c. Ống 3: lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1% không thấy xuất hiện tủa bông trắng Phản ứng âm tính.
Kết quả: 2 phản ứng a, b dương tính. Phản ứng c âm tính. Kết luận sơ bộ: Thân rễ Ngải tiên không có tannin.
3.2.2.6. Định tính anthranoid.
a. Phản ứng Borntraeger
Định tính anthranoid toàn phần (dạng glycosid và dạng tự do)
Cho vào ống nghiệm lớn 1g thân rễ Ngải tiên. Thêm 5ml dung dịch acid sulfuric 1N. Đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi. Lọc dịch chiết còn nóng qua một lớp bông mỏng vào trong bình gạn dung tích 50ml. Làm nguội dịch lọc. Thêm 5ml chloroform, lắc nhẹ, gạn bỏ lớp nước. Giữ lớp cloroform để làm phản ứng.
Lấy 1ml dịch chiết cloroform, thêm 1ml dung dịch amoniac. Lắc nhẹ. Không thấy lớp nước xuất hiện màu đỏ sim Phản ứng âm tính.
Kết luận sơ bộ:Thân rễ Ngải tiên không có anthranoid.
3.2.2.7. Định tính glycosid tim.
Lấy 3g thân rễ Ngải tiên, chiết soxhlet với n-hexan 1 giờ. Bã dược liệu sấy khô, cho vào bình cầu, đun hồi lưu với ethanol 40% trong 1 giờ. Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ, thêm khoảng 3ml chì acetat 30%, khuấy đều. Lọc loại tủa, thử dịch lọc vẫn còn tủa với chì acetat, cho thêm 1ml chì acetat nữa vào dịch chiết, khuấy và lọc lại. Tiếp tục thử đến khi dịch chiết không còn tủa với chì acetat. Cho toàn bộ dịch lọc vào bình gạn và lắc kỹ với hỗn hợp chloroform:ethanol tỷ lệ 4:1 (3 lần, mỗi lần 5ml), gạn lấy lớp chloroform vào cốc có mỏ khô sạch. Chia dịch chiết vào 6 ống nghiệm nhỏ, bốc hơi dung môi trên nồi cách thuỷ cho đến khô. Cắn còn lại để làm