CHLOROFORM THÂN CÂY Ý DĨ
Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của HDCL trên các mô hình thực nghiệm khác nhau và so sánh với chứng dương là các thuốc điều trị ĐTĐ kinh điển đã phần nào giúp định hướng về cơ chế tác dụng của thân Ý dĩ. Tuy nhiên, cơ chế tác dụng của dược liệu này tiếp tục được thực hiện thông qua đánh giá tác dụng của mẫu thử trên một số chỉ số về hóa sinh, bệnh học khác.
Sau khi khẳng định được tác dụng của HDCL trên chuột bị tăng glucose huyết bởi STZ liều 150 mg/kg, thí nghiệm này được lặp lại với mục đích kiểm tra cơ chế tác dụng của phân đoạn chiết chlorroform thân cây Ý dĩ có phải thông qua insulin hay không? Chúng tôi tiến hành định lượng nồng độ insulin trong huyết thanh của 4 lô chuột.
Kết quả (bảng 3.4) cho thấy trong 4 lô chuột thí nghiệm, chỉ có lô 3 (chuột uống gliclazid) nồng độ insulin huyết thanh tăng cao hơn một cách có ý nghĩa thống kê (p<0,01). Tác dụng làm hạ glucose huyết ở lô 3 là do gliclazid với cơ chế phong bế kênh K+ phụ thuộc ATP của tế bào beta, do đó, làm giảm nồng độ K+, gây khử cực màng và mở kênh Ca2+ phụ thuộc điện thế, kết quả là làm tăng giải phóng insulin từ tế bào beta [60]. Với cơ chế tác dụng đó, gliclazid được dùng trong ĐTĐ, khi tụy vẫn còn khả năng bài tiết insulin. Ở lô 2 và lô 4, mặc dù nồng độ insulin thấp nhưng chuột vẫn có glucose huyết giảm, chứng tỏ phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ có tác dụng tương tự như metformin, với cơ chế chủ yếu do làm tăng tác dụng của insulin ở mô đích hơn là tăng số lượng insulin [16].
Như vậy, xu hướng tác dụng của thân Ý dĩ là trên ĐTĐ typ 2. Do vậy, thí nghiệm tiếp theo được tiến hành trên chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm. Mô hình ĐTĐ typ 2 áp dụng trong nghiên cứu này đã thể hiện những rối loạn chuyển hóa
60
tương tự như những đặc điểm bệnh học thường gặp ở bệnh nhân ĐTĐ typ 2. Kết quả ở hình 3.7 và bảng 3.6 cho thấy nồng độ insulin huyết thanh, glucose huyết của lô chuột ĐTĐ typ 2 không điều trị cao khác biệt so với chuột bình thường, kết quả này thể hiện mức độ kháng insulin rất rõ ràng. Sau 15 ngày điều trị, nồng độ insulin huyết thanh của lô 2 và lô 3 có giảm nhưng vẫn khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô 1. Sự giảm nồng độ insulin huyết thanh đi kèm với giảm glucose huyết này có thể là biểu hiện của sự cải thiện tình trạng kháng insulin, làm giảm áp lực bài tiết insulin của tế bào beta. Tuy nhiên, với thời gian điều trị 15 ngày có thể chưa tạo được những tác động cần thiết để nồng độ insulin giảm đến mức có ý nghĩa thống kê.
Giả thiết trên được kiểm chứng thông qua thực nghiệm đánh giá tác động của HDCL trên tình trạng mô tụy nội tiết của chuột ĐTĐ typ 2. Kết quả tiêu bản vi phẫu tụy thể hiện trong hình 3.6 cho thấy ở lô ĐTĐ typ 2 không điều trị, xuất hiện những dấu hiệu rõ ràng của sự suy giảm vế số lượng và thoái hóa tiểu đảo tụy. Hiện tượng này đi kèm với nồng độ insulin huyết thanh tăng cao (hình 3.5) chứng tỏ tế bào beta của tiểu đảo tụy đã phải làm việc quá mức để giải phóng một lượng lớn insulin nhằm đáp ứng với tình trạng glucose máu cao, dẫn đến xu hướng suy kiệt của tiểu đảo tụy. Hình ảnh vi phẫu đã giải thích kết quả định lượng nồng độ insulin huyết thanh của chuột ĐTĐ typ 2 tăng cao gấp 1,7 lần so với lô chuột bình thường. Tình trạng tụy của chuột ĐTĐ typ 2 trong đề tài tương đối giống với mô tả của Rhodes về diễn biến tình trạng tụy trên người béo phì có xu hướng kháng insulin. (hình 4.1)
61
Hình 4.1. Tiêu bản mô học tiểu đảo tụy của người bình thường, người bệnh béo phì không ĐTĐ, người bệnh ĐTĐ typ 2 [57]
Ở người bình thường, tế bào beta tập trung tạo thành nhân của tiểu đảo, chiếm khoảng 70% tổng số tế bào nội tiết của tụy. Ở người béo phì không bị ĐTĐ nhưng đã có xu hướng kháng insulin, số lượng và cả kích thước tiểu đảo tụy tăng lên, chủ yếu do sự tăng số lượng và kích thước của tế bào beta, 90% số tế bào nội tiết của tuyến tụy là tế bào beta. Ngược lại, ở người bệnh ĐTĐ typ 2, số lượng tế bào beta giảm, các tiểu đảo tụy có xu hướng biến dạng và phân bố lộn xộn. Trong mỗi tiểu đảo, số lượng tế bào beta giảm đáng kể, thay vào đó là sự xâm chiếm của các đám amyloid [57]
Bình thường
Béo phì nhưng không bị ĐTĐ
62
Ở 2 lô điều trị là lô 2 và lô 3, (hình 3.7 và 3.8), mặc dù tiểu đảo tụy vẫn giảm về số lượng, kích thước so với bình thường nhưng không còn dấu hiệu tổn thương như lô 1, điều này chứng tỏ tình trạng kháng insulin đã được cải thiện. Kết quả vi phẫu này phù hợp với sự giảm nhẹ nồng độ insulin huyết thanh của 2 lô điều trị. Việc so sánh với thuốc đối chứng metformin một lần nữa giúp nhận định cơ chế tác dụng của thân Ý dĩ thông qua làm giảm kháng insulin, từ đó giúp cho tụy có khả năng tự phục hồi.
Như vậy, giống như metformin, tác dụng làm giảm glucose huyết của thân Ý dĩ không thông qua cơ chế kích thích giải phóng insulin ở tuyến tụy. Cơ chế tác dụng của thân Ý dĩ có thể là làm giảm kháng insulin hoặc có khả năng điều hòa các quá trình chuyển hóa tương tự như insulin.
Giả thuyết về tác dụng giảm kháng insulin tiếp tục được củng cố thông qua việc đánh giá ảnh hưởng của HDCL trên khả năng dung nạp glucose của chuột ĐTĐ typ 2. Kết quả ở hình 3.10 thể hiện nồng độ glucose huyết khác nhau giữa lô 1 (lô chứng bệnh ) với lô 2 và lô 3 tại các thời điểm tương ứng (p<0,01). Nồng độ glucose huyết của các lô chuột đều tăng cao sau 30 phút sau uống dung dịch glucose. Tuy nhiên, ở lô 1, sau 2 giờ, glucose huyết vẫn còn khá cao so với ban đầu trong khi ở 2 lô điều trị, glucose huyết trở về gần như ban đầu sau 2 giờ. Sự tồn lưu glucose trong máu của 3 lô chuột khi uống glucose liều 3g/kg thể trọng còn được thể hiện thông qua sự khác biệt về diện tích dưới đường cong glucose (AUC - hình 3.11). Sự tăng AUC glucose của chuột ĐTĐ typ 2 trong thí nghiệm này của chúng tôi phù hợp với các kết quả của các tác giả khác khi tiến hành test dung nạp glucose trên chuột cống gây ĐTĐ typ 2 bằng chế độ ăn giàu béo và tiêm STZ liều thấp [37], [53], [61].
Như vậy, việc điều trị bằng HDCL làm tăng sự dung nạp glucose ở các tế bào. Tác dụng này có thể do tăng sự thu nhận glucose vào tế bào, tăng sử dụng
63
glucose trong tế bào do tăng hoạt động của insulin. Trong thí nghiệm này, tác dụng của lô chuột uống HDCL tương tự như lô uống metformin là thuốc từ lâu đã được chứng minh có cơ chế tác dụng là làm tăng sử dụng glucose ở tế bào, cải thiện liên kết của insulin với thụ thể và sau thụ thể, ức chế tổng hợp glucose ở gan. Do đó, kết quả của thực nghiệm này một lần nữa giúp định hướng về cơ chế tác dụng tương tự metformin của thân Ý dĩ.
Để tiếp tục tìm hiểu cơ chế tác dụng của thân Ý dĩ, chúng tôi đánh giá ảnh hưởng của HDCL trên hoạt độ G6Pase ở gan của các lô chuột thí nghiệm.
G6Pase là enzym xúc tác cho phản ứng cuối cùng của con đường tân tạo đường, giải phóng glucose tự do vào máu. G6Pase được coi là một enzym chủ chốt, quyết định tốc độ của cả quá trình tân tạo đường, do đó gián tiếp ảnh hưởng đến nồng độ glucose huyết. G6Pase chỉ có mặt ở tế bào gan và một lượng nhỏ ở thận. Điều này quyết định gan là cơ quan quan trọng nhất có chức năng tổng hợp glucose cung cấp cho máu và các mô ngoại vi. Các mô khác mặc dù có sẵn nguyên liệu tổng hợp glucose như cơ (có nhiều lactat giải phóng sau quá trình co cơ) hay mô mỡ (có nhiều các sản phẩm của đường phân) nhưng không có khả năng sản xuất glucose tự do giải phóng vào máu do thiếu G6Pase. Ngoài vai trò quan trọng trong tân tạo đường, G6Pase còn xúc tác cho phản ứng cuối cùng của quá trình thoái hóa glycogen để tạo thành glucose tự do giải phóng vào máu. Do đó, G6Pase có vai trò rất quan trọng đối với sự tạo thành glucose nội sinh trong cơ thể.
Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy hoạt độ G6Pase gan của chuột nhắt trắng gây tăng glucose huyết bởi STZ (150mg/kg), tăng cao rõ rệt (151,72 %) so với lô chuột bình thường (p<0,05). Sau khi uống mẫu thử, hoạt độ G6Pase của 3 lô điều trị (uống cắn phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ, gliclazid, metformin) giảm một cách có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh (p<0,05). Kết quả trên
64
mô hình này phù hợp với nhiều nghiên cứu đã chứng minh: ngoài tác dụng tăng cường thu nhận glucose từ máu vào các mô, insulin trực tiếp điều hoà các enzym chủ chốt trong quá trình tổng hợp và thoái hoá glucose theo hướng tăng cường các enzym thoái hoá glucose và ức chế các enzym tổng hợp glucose trong đó có G6Pase. Ở bệnh nhân ĐTĐ cũng như trên động vật ĐTĐ thực nghiệm, do suy giảm khả năng điều hòa chuyển hóa của insulin, hoạt độ G6Pase tăng cao, dẫn đến tăng tổng hợp glucose, tăng glucose huyết [51], [61] do đó, nó cũng là nguyên nhân làm nặng thêm tình trạng tăng glucose huyết của bệnh nhân ĐTĐ. Trong thực tế, ức chế G6Pase là một cơ chế làm giảm glucose máu được phát hiện ở nhiều dược liệu và là một đích tiềm năng trong thiết kế thuốc mới điều trị ĐTĐ [44], [52].
Kết quả về hoạt độ G6Pase trên chuột ĐTĐ typ 2 (bảng 3.7) cho thấy hoạt độ enzym này ở chuột ĐTĐ typ 2 cũng tăng rõ rệt so với chuột bình thường. Sau đợt điều trị 15 ngày, hoạt độ G6Pase ở cả 2 lô uống HDCL (16,5mg/kg) và metformin (120mg/kg) đều giảm một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
Như vậy, trên cả 2 mô hình thực nghiệm, thân Ý dĩ đều có tác dụng ức chế G6Pase gan. Thuốc đối chứng sử dụng trong các mô hình này là metformin, một thuốc mà từ lâu đã được chứng minh là có tác dụng ức chế tân tạo đường thông qua ức chế G6Pase [48]. Đây là lần đầu tiên có một công bố về tác dụng ức chế G6Pase của thân Ý dĩ. Kết quả này một lần nữa cho thấy có sự tương đồng về cơ chế tác dụng của dược liệu này với metformin. Về lý thuyết, tác dụng ức chế này có thể do các hoạt chất trong thân Ý dĩ trực tiếp tác động lên enzym G6Pase hoặc do gián tiếp thông qua tác dụng làm tăng nhạy cảm của mô đích với insulin, một hormon nội sinh có tác dụng ức chế tân tạo đường. Để làm sáng tỏ điều này, cần có thêm những thí nghiệm in vitro trên hoạt độ G6Pase tinh khiết hoặc đánh giá
65
ảnh hưởng trực tiếp của hoạt chất trong thân Ý dĩ trên mức độ biểu hiện gen của G6Pase.
Các giả thuyết về cơ chế tác dụng của thân Ý dĩ thu được từ các thực nghiệm in vivo chủ yếu hướng vào cơ chế làm tăng nhạy cảm của mô đích với insulin. Do đó, một thực nghiệm in vitro được sử dụng trong đề tài là thử tác dụng ức chế PTP1B của cắn phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ.
PTP1B hiện đang là một đích tác dụng được chú ý của nhiều nhà khoa học trong việc tìm kiếm thuốc làm giảm kháng insulin [42]. Vai trò điều hòa ngược con đường truyền tin nội bào của insulin của PTP1B đã được chứng minh rõ ràng. PTP1B gây khử phosphoryl của phân tử tyrosin trong insulin receptor (IR) và insulin receptor substrate (IRS) do đó gây giảm tác dụng của insulin trên tế bào [15], [26]. Ngoài ra, PTP1B còn có vai trò điều hòa ngược con đường dẫn truyền thông tin nội bào của leptin trong tế bào[42]. Do đó các chất có tác dụng ức chế PTP1B làm tăng nhạy cảm của tế bào với insulin Trong thực tế, chuột nhắt gây đột biến làm thiếu hụt PTP1B có khả năng đề kháng với béo phì, tăng nhạy cảm với insulin, loại chuột này không bị béo phì khi cho ăn chế độ ăn giàu chất béo [42]. Kết quả thể hiện trong bảng 3.8 cho thấy, cắn phân đoạn chiết chloroform thể hiện tác dụng ức chế PTP1B phụ thuộc vào nồng độ cắn. Nồng độ cao nhất (60 µg/mL) có mức độ ức chế tương đương với chứng dương là acid ursolic, một chất đã được chứng minh là có tác dụng ức chế mạnh PTP1B [8]. PTP1B được coi là yếu tố điều hòa âm tính đối với hoạt động của insulin ở mô đích. Như vậy, với khả năng ức chế enzym này, thân Ý dĩ làm tăng cường sự nhạy cảm của mô đích và hoặc cơ chế ức chế tân tạo đường. Kết quả này phù hợp với các kết quả in vivo đã thu được. Ức chế PTP1B cũng là cơ chế đã được chứng minh của nhiều dược liệu dùng trong điều trị ĐTĐ typ 2 [8 ], [15 ].
66
Các kết quả nghiên cứu của luận văn đã cho thấy thân Ý dĩ không có tác dụng làm giảm glucose huyết ở chuột bình thường, nhưng lại giảm glucose huyết ở chuột tăng glucose huyết thực nghiệm. Các kết quả định lượng hóa sinh, mô bệnh học tụy và khả năng ức chế PTP1B đều thể hiện cơ chế tác dụng hạ glucose huyết của phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ không phải thông qua insulin mà chủ yếu do làm tăng hiệu quả hoạt động của insulin ở mô đích. Các kết quả này là bằng chứng khoa học giúp cho việc khai thác và sử dụng một nguồn nguyên liệu từng bị coi là phế phẩm trong điều trị ĐTĐ, đặc biệt là ĐTĐ typ 2.
67
KẾT LUẬN
Lần đầu tiên ở Việt Nam, Phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ đã được nghiên cứu một cách tương đối có hệ thống về tác dụng sinh học. Trên cơ sở các kết quả của đề tài chúng tôi đưa ra các kết luận như sau:
1. Tác dụng hạ glucose huyết
- Phân đoạn chloroform thân cây Ý dĩ không có có tác dụng hạ glucose huyết trên chuột bình thường
- Tác dụng trên glucose huyết của chuột gây tăng glucose huyết thực nghiệm
+ Trên chuột gây đái tháo đường bởi STZ liều 150 mg/kg, sau 7 ngày cho chuột uống cắn phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ (33mg/kg) glucose huyết hạ 50,84 % so với thời điểm ban đầu.
+ Trên chuột ĐTĐ typ 2, sau 15 ngày uống cắn phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ (16,5mg/kg) glucose huyết hạ 30,38 % so với thời điểm ban đầu.
2. Cơ chế tác dụng của phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ
- Cơ chế tác dụng hạ glucose huyết thông qua các chỉ số hóa sinh, mô bệnh học, ức chế PTP1B, dung nạp glucose.
+ Cắn phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ có tác dụng ức chế enzym G6Pase gan trên chuột ĐTĐ bởi STZ (150mg/kg) là 43,1%. Trên chuột ĐTĐ typ 2 mức độ ức chế là 38,65% so với chuột không được điều trị
+ Trên mô bệnh học tụy, cắn phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ không phải do tác động trực tiếp lên tiểu đảo tụy mà gián tiếp thông qua sự cải thiện tình trạng kháng insulin, làm giảm gánh nặng cho tụy, giúp tụy có khả năng tự phục hồi.
68
+ Cắn phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ liều 60µg/ml có tác dụng ức chế PTP1B 45,02%
+ Cắn phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ liều 16,5 mg/kg tăng dung nạp glucose chuột cống ĐTĐ typ 2.
- Từ kết quả trên cơ chế tác dụng hạ glucose huyết của phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ như sau:
+ Làm giảm tính kháng insulin, tăng nhạy cảm với insulin + Ức chế quá trình tân tạo glucose ở gan
+ Tăng dung nạp glucose vào trong tế bào
ĐỀ XUẤT
Từ các kết quả nghiên cứu thu được, có thể thấy thân cây Ý dĩ là một dược liệu có triển vọng trong điều trị ĐTĐ. Với nguồn nguyên liệu dồi dào trong nước, để có thể sử dụng thân cây Ý dĩ một cách hiệu quả trong điều trị ĐTĐ, đề