HDCL
- Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng loại nhóm phosphat ở phân tử tyrosin đã được phosphoryl hóa (pTyr 1158) trong tiểu đơn vị beta của insulin receptor dưới tác dụng của protein tyrosin phosphatase 1B (PTP1B). Cụ thể, trong thí nghiệm này cơ chất của PTP1B được sử dụng là một đoạn polypeptid của tiểu đơn vị beta của insulin receptor trong đó phân tử tyrosin 1158 đã được phosphory hóa (cơ chất này được đặt tên là IR5). Phần phospho tự do (Pi) tạo ra từ phản ứng này được định lượng dựa trên phản ứng giữa xanh malachit, ammonium molybdat và Pi trong môi trường acid [8], [15], [42].
Định lượng xanh malachit phosphomolybdat tạo thành bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 620nm. Lượng xanh malachit phosphomolybdat tạo thành tỷ lệ với lượng phosphat tự do (Pi) có trong hỗn hợp phản ứng.
- Tiến hành: sử dụng bộ kít định lượng PTP1B (Biomol International L.P.) với mẫu thử là cắn của phân đoạn chiết chloroform và mẫu chứng dương là acid ursolic được pha trong dung môi DMSO. Enzym PTP1B và cơ chất (IR5) được pha trong đệm (có chứa 100mM MES; pH 6,0; 300mM NaC1; 2mM EDTA; 2mM 1,4- dithiothreitol; 0,1% NP-40). Tiến hành đồng thời các phản ứng với thành phần phản ứng và nồng độ cuối cùng trong hỗn hợp phản ứng như bảng 2.3. Thể tích hỗn hợp phản ứng cuối cùng trong mỗi ống nghiệm là 100µL.
35 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng đánh giá tác dụng trên PTP1B Lô Thành phần phản ứng Chứng trắng Chứng Chứng thử Mẫu thử Chứng chứng dương Chứng dương Đệm (pH=6,0) DMSO 0,1% Mẫu thử Acid ursolic 3,5µ M PTP1B 3ng/giếng IR5: 75µL
*: HDCL được thử với các nồng độ cuối cùng là 60 µg/mL; 40 µg/mL; 20 µg/mL; 10 µg/mL. Mỗi nồng độ được thử trong 4 giếng, lấy kết quả trung bình.
- Ủ các mẫu thử/mẫu chứng dương với enzym trong thời gian 15 phút - Bổ sung cơ chất vào hỗn hợp phản ứng trên và ủ ở 370 C trong 30 phút - Bổ sung BML-AK111 BIOMOL GREENTM REAGENT (20µL), để ở
nhiệt độ phòng trong 30 phút. - Đo quang ở bước sóng 620nm
- Tỷ lệ phần trăm ức chế hoạt động của PTP1B tính theo công thức:
Trong đó:
I: tỷ lệ phần trăm ức chế hoạt động của enzym
A chứng = mật độ quang của lô chứng – mật độ quang của lô chứng trắng
A thử = mật độ quang của lô mẫu thử - mật độ quang của lô chứng thử A chứng – A thử
I = *100 A chứng
36