2.1.1. Dược liệu nghiên cứu
Thân Ý dĩ được thu hái tại Hải Dương. Mẫu dược liệu được định danh khoa học và lưu tại phòng tiêu bản thực vật Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật - Viện khoa học và công nghệ Việt Nam. Dược liệu được thu hoạch vào tháng 10 - 11 năm 2011. Thân cây Ý dĩ được rửa sạch, phơi trong bóng râm, sấy ở 50oC đến hàm ẩm còn khoảng 10%, tán thành bột thô. Bột dược liệu được chiết xuất rồi thu phân đoạn chiết chloroform theo quy trình trong hình 2.2.
Hình 2.1. Hình ảnh thân cây Ý dĩ (Coix lachryma-jobi (L). var. ma-yuen Stapf)
2.1.2. Động vật thí nghiệm
- Chuột nhắt trắng, giống đực chủng Swiss, trọng lượng 18 - 22g, khoẻ mạnh, do viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp.
23
- Chuột cống trắng, giống đực, chủng Wistar, khỏe mạnh, trọng lượng 80 20g, khỏe mạnh, do học viện Quân Y cung cấp.
Động vật thí nghiệm sau khi mua được cho ăn thức ăn tổng hợp và cho uống nước tự do tại phòng nuôi động vật thí nghiệm Bộ môn Dược lý, Trường Đại học Dược Hà Nội và Bộ môn Hoá dược, trường Cao đẳng dược Trung ương Hải Dương.
2.1.3. Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu
2.1.3.1. Thiết bị, dụng cụ
- Máy đo glucose huyết Accu-Check Active và que thử tương ứng của Roche -Đức
- Máy ly tâm lạnh Heraeus Sepatech - Đức.
- Máy đo quang phổ UV-VIS U1800 Hitachi - Nhật Bản
- Hệ thống máy ELISA gồm có máy lắc, đầu đọc có gắn liền với máy tính và máy in của hãng Bio-Tek Instrument, máy ủ ASYS Hitech - Mỹ
- Máy cất quay Rotavapor R-210 Buchi - Thụy Sĩ
2.1.3.2. Hóa chất nghiên cứu
- Streptozocin (STZ) bột pha tiêm của hãng MP Biochemicals, LCC - Pháp - Metformin HCl (glucophage), dạng viên nén 500mg, Merch-Lipa Santa - Đức.
- Gliclazid viên nén 20mg, Servier industrie - Pháp.
- Glucose 6 phosphat (G6P), Fluka biochemie Gmbh - Đức.
- Kít định lượng insulin chuột cống (Ultrasensitive Rat ELISA kít) gồm các dung dịch chuẩn, cộng hợp enzym, dung dịch rửa, cơ chất 3,3’,5,5’ tetramethylbenzidin, dung dịch dừng phản ứng và bản nhựa với các giếng tráng sẵn kháng thể đơn dòng kháng insulin chuột của hãng Crystal chem – Mỹ.
24
- Bộ kít định lượng PTP1B bao gồm enzym PTP1B, cơ chất IR5, BIOMOL Red Reagent và các dung dịch đệm cần thiết khác của hãng Biomol International L.P - Mỹ.
- Acid urolic Biomol International L.P - Mỹ.
- Albumin huyết thanh bò (fetal bovine serum: FBS), HEPES (4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethane sulfonic acid) của hãng Invitrogen - Đức - Các dụng cụ và hóa chất khác đạt tiêu chuẩn thí nghiệm.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp chiết xuất dược liệu và điều chế mẫu thử
- Phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ được chiết xuất theo quy trình sau:
25
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình chiết xuất phân đoạn chloroform thân cây Ý dĩ
Hiệu suất thu cắn phân đoạn chloroform được tính theo công thức : H % = mc
mdl x 100 Trong đó : (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
H % : Hiệu suất thu cắn.
Dược liệu (2kg) Dịch chiết EtOH Dịch chiết đậm đặc Lớp n-hexan Cắn CHCl3 ( Cchloroform) Lớp nước + Ngâm lạnh.
+ Dung môi EtOH 80o
Cất thu hồi dung môi
+ Nước
+ n- hexan (500mL x 5 lần )
Lớp nước
+ CHCl3 ( 500mL x 5 lần)
Cất thu hồi dung môi Lớp CHCl3
26
mc: Khối lượng cắn thu được (g).
mdl : Khối lượng dược liệu đã trừ độ ẩm (g).
Hàm ẩm của dược liệu được xác định bằng máy đo độ ẩm Satorius là 10,04%. Như vậy, hiệu suất thu cắn phân đoạn chloroform là :
) 1004 , 0 1 ( 2000 97 , 5 % H × 100 = 0,33 %
Cắn phân đoạn chiết chloroform được được tiêu chuẩn hoá bằng cách xác định hàm ẩm, định tính bằng sắc ký lớp mỏng, phân lập và xác định cấu trúc một số chất (phụ lục 1)
- Mẫu thử dùng trong nghiên cứu là hỗn dịch HDCL được pha như sau: Cắn của phân đoạn chiết chloroform được nghiền thật mịn, sau đó pha hỗn dịch 1:1 (w/v) trong dung dịch natri carboxymethyl cellulose (NaCMC) 0,5%.
- Mẫu chứng dương là metformin HCl viên nén 500 mg và gliclazid viên nén 20mg được nghiền thật mịn sau đó pha thành hỗn dịch trong dung dịch natri carboxymethyl cellulose (NaCMC) 0,5%.
Các lô chuột thí nghiệm sẽ được uống các mẫu thử với cùng một thể tích (chuột nhắt uống 0,2 mL/20g chuột, chuột cống uống 0,2 mL/50g chuột)
2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của HDCL trên chuột thực nghiệm
Năm 2009, Phùng Thanh Hương, Nguyễn Thị Đông đã tiến hành khảo sát tác dụng hạ glucose huyết của các liều dịch chiết thân Ý dĩ khác nhau. Kết quả cho thấy liều 10g thân ý dĩ khô /kg chuột nhắt là liều thấp nhất có tác dụng hạ glucose huyết tốt [3]. Trên cơ sở đó, chúng tôi lựa chọn liều của mẫu thử HDCL cho các thực nghiệm trong đề tài này là: 10g/kg chuột nhắt và 5,0g/kg chuột cống tính theo số g dược liệu khô tương ứng/ kg thể trọng. Với hiệu suất chiết là 0,33%, liều quy đổi là 33mg cắn/kg thể trọng chuột nhắt và 16,5 mg/kg thể trọng chuột cống là liều dùng trong nghiên cứu.
27
2.2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của HDCL trên chuột nhắt trắng bình thường
Tiến hành: chuột nhắt trắng sau khi được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm 5 ngày, được chia thành 2 lô:
- Lô 1 (Lô đối chứng, n =10): uống dung môi pha HDCL - Lô 2 (Lô thử, n =10): uống HDCL liều 33mg/kg thể trọng
Cho chuột uống mẫu thử liên tục trong 7 ngày vào một giờ nhất định. So sánh glucose huyết lúc đói của chuột trước và sau đợt thử nghiệm. Glucose huyết lúc đói là nồng độ glucose trong máu toàn phần tĩnh mạch đuôi chuột sau khi đã nhịn đói 10 giờ.
2.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của HDCL trên chuột nhắt trắng tăng glucose
huyết thực nghiệm bằng STZ
a) Gây tăng glucose huyết bằng streptozocin (STZ) trên chuột nhắt trắng
Sử dụng phương pháp gây tăng glucose huyết trên chuột nhắt thí nghiệm với liều hai liều STZ 200mg/kg và 150 mg/kg tiêm màng bụng [9], [26]. Sau 72 giờ, lựa chọn các chuột có glucose huyết trên 11,0 mmol/L là chuột tăng glucose huyết thực nghiệm để dùng cho nghiên cứu.
b) Trên mô hình tăng glucose huyết thực nghiệm bởi STZ liều 200 mg/kg (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành: chuột nhắt trắng sau khi đã bị gây tăng glucose huyết thực nghiệm được chia thành 4 lô:
+ Lô 1 (Lô chứng bệnh , n=10): cho uống dung môi pha HDCL (0,2ml/20 g thể trọng)
+ Lô 2 (Lô thử, n=10): cho uống HDCL với liều 33mg/kgthể trọng
+ Lô 3 (Lô chứng dương, n=10): cho uống gliclazid với liều 20mg/kg thể trọng.
+ Lô 4 (Lô chứng dương, n=10): cho uống metformin với liều 240mg/kg thể trọng.
28
Cho chuột uống mẫu thử liên tục trong 7 ngày vào một giờ nhất định. Sau 7 ngày, định lượng glucose huyết lúc đói của các lô chuột.
c) Trên mô hình tăng glucose huyết thực nghiệm bởi STZ liều 150 mg/kg
- Tiến hành tương tự như mô tả trong phần b). Sau 7 ngày, định lượng glucose huyết lúc đói của các lô chuột
- Sau đó, tiến hành lặp lại thí nghiệm trên với 5 lô chuột: 4 lô đầu tương tự như mô tả trong phần b), lô 5 là chuột bình thường cho uống dung môi pha HDCL. Chuột được uống mẫu thử liên tục 7 ngày, định lượng glucose huyết lúc đói của chuột, tiếp theo lấy máu mắt ly tâm thu huyết thanh để định lượng insulin. Sau đó, mổ lấy gan xác định hoạt độ G6Pase.
2.2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của HDCL trên chuột cống trắng gây ĐTĐ typ 2 thực nghiệm 2 thực nghiệm
a) Gây mô hình ĐTĐ typ 2 thực nghiệm
Sử dụng mô hình gây ĐTĐ thực nghiệm kiểu ĐTĐ typ 2 dựa trên chế độ ăn giàu chất béo kết hợp với STZ liều thấp của Leelavinothan, Vicker S.P, [44], [68]. Mô hình này đã được triển khai tại Việt Nam bởi Phùng Thanh Hương và Đỗ Thị Nguyệt Quế [4], [8] gồm hai bước:
- Bước 1: Gây kháng insulin bằng chế độ ăn giàu chất béo
Chuột cống đực trắng chưa trưởng thành có cân nặng trung bình 80g được nuôi bằng chế độ ăn giàu lipid với 60% tổng số calo của khẩu phần ăn là chất béo được tính theo bảng thành phần dinh dưỡng thực phẩm Việt Nam của Viện Dinh Dưỡng [11]. Tiến hành trong cùng điều kiện 1 lô đối chứng là chuột bình thường được ăn chế độ ăn chứa 12% tổng số calo của khẩu phần ăn là chất béo (bảng 2.1). Cả hai lô chuột được cho ăn với hai loại thức ăn tương ứng trong vòng 60 ngày.
29
Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng trong khẩu phần ăn của chuột thí nghiệm [4], [8]
Carbohydrat Protein Chất béo Các thành phần khác Thức ăn của lô chuột
thường 60% 20% 12% 8%
Thức ăn giàu chất béo 20% 19% 60% 1%
(Tỷ lệ % tính theo calo tổng số)
- Bước 2: Gây ĐTĐ cho chuột đã bị kháng insulin
Tiêm màng bụng dung dịch STZ với liều 50mg/kg (pha trong đệm citrat pH=4,5) cho nhóm chuột ăn chế độ ăn giàu chất béo. Sau 72 giờ lấy máu định lượng glucose huyết lúc đói của chuột (chuột đã nhịn đói 10 giờ). Những chuột có glucose huyết trên 11 mmol/L được lựa chọn vào nghiên cứu tiếp theo.
b) Bố trí thí nghiệm
- Ảnh hưởng của HDCL trên các chỉ số hóa sinh và tình trạng mô bệnh học của chuột cống trắng gây ĐTĐ typ 2
Bố trí thí nghiệm với 4 lô chuột trong đó:
+ Lô 1: Chứng bệnh (n=8): chuột ĐTĐ typ 2 được cho uống dung môi pha HDCL
+ Lô 2: Lô thử (n=8): chuột ĐTĐ typ 2 được cho uống HDCL (16,5 mg/kg) + Lô 3: Chứng dương (n=8): chuột ĐTĐ typ 2 được cho uống cho uống metformin với liều 120mg/kg
+ Lô 4: Chứng thường (n=8): chuột bình thường, ăn thức ăn bình thường được cho uống dung môi pha HDCL
Cho chuột uống mẫu thử tương ứng liên tục trong 15 ngày. Sau 15 ngày, cho chuột nhịn đói 10 giờ, cân chuột, lấy máu toàn phần từ đuôi chuột để định lượng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
30
glucose huyết, lấy máu mắt ly tâm thu huyết thanh để định lượng insulin. Sau cùng mổ chuột lấy gan và tụy để xác định hoạt độ enzym G6Pase gan và kiểm tra đại thể, vi thể tụy của tất cả các chuột trong mỗi lô.
2.2.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của HDCL trên khả năng dung nạp glucose của chuột cống trắng gây ĐTĐ typ 2
Chuột bị ĐTĐ typ 2 thực nghiệm được chia thành 3 lô:
- Lô 1: Lô chứng bệnh (n=8) Cho uống dung môi pha HDCL - Lô 2: Lô thử (n=8): Cho uống HDCL với liều 16,5 mg/kg - Lô 3: Lô chứng dương uống metformin với liều 120mg/kg
Cho chuột uống mẫu thử liên tục trong 7 ngày, ngày thứ 8, cho chuột nhịn đói 10 giờ, sau đó cho uống mẫu thử bình thường. 2h sau tiếp tục cho uống dung dịch glucose 30% liều 3g/kg thể trọng (glucose pha dung dịch ở dạng khan, thể tích cho uống là 0,2mL/ 50g chuột). Định lượng glucose huyết sau khi uống dung dịch glucose ở các thời điểm 0 phút; 30 phút; 60 phút, 90 phút và 120 phút. Ảnh hưởng của HDCL lên sự dung nạp glucose của chuột ĐTĐ typ 2 được đánh giá bằng diện tích dưới đường cong (AUC) glucose trong vòng 120 phút thí nghiệm [37], [53], [61].
2.2.3. Các kỹ thuật định lượng hóa sinh
2.2.3.1. Định lượng glucose huyết
Tiến hành theo phương pháp glucose oxidase dựa trên mô tả của Yuen và Mc Neill với máy đo glucose huyết Accu-Check Active và bộ kit tương ứng của Roche - Đức[54]. Địa điểm thực hiện tại trường cao đẳng Dược TW – HD
- Nguyên tắc: oxi hóa glucose thành acid gluconic theo phản ứng (1) Glucose + H2O + O2 Glucose oxidase Acid gluconic + H2O2 (1) H2O2 tạo thành bị peroxidase phân hủy, giải phóng oxi, oxy hóa o-dianisidin để tạo thành phức chất có màu vàng nâu theo phản ứng (2).
31 O-Dianisidin + H2O2
peroxidase
phức hợp vàng nâu + H2O (2) Cường độ màu được xác định bằng phương pháp đo quang tương ứng với lượng glucose cần định lượng. Máu để định lượng glucose huyết là máu toàn phần lấy từ tĩnh mạch đuôi chuột sau khi đã bỏ đi giọt máu đầu tiên.
2.2.3.2. Định lượng insulin huyết thanh
Theo phương pháp định lượng hấp phụ miễn dịch liên kết enzym 2 lớp (sandwich ELISA) với bộ sinh phẩm định lượng insulin chuột (Ultrasensitive Rat ELISA kit của hãng Crystal Chem), thực hiện tại bộ môn Dược lý, trường Đại học Dược Hà Nội
- Nguyên tắc: insulin trong mẫu thử phản ứng với kháng thể kháng insulin liên kết với enzym peroxidase và kháng thể kháng insulin cố định trên giếng phản ứng. Sau khi rửa để loại bỏ các kháng thể không gắn, phát hiện các kháng thể gắn bằng phản ứng với 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidin. Dừng phản ứng bằng dung dịch acid sulfuric 1 N, đo màu ở bước sóng 450 nm và 630 nm [70].
- Pha các dung dịch insulin chuẩn theo bảng 2.2 để xây dựng đường chuẩn
Bảng 2.2. Thành phần của các dung dịch insulin chuẩn
Nồng độ insulin chuột
6,4 3,2 1,6 0,8 0,4 0,2 0,1 0,0 Mẫu chuẩn insulin
chuột (µL) 50 Dung dịch pha loãng mẫu (µL) 150 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Tổng (µL) 200 100 100 100 100 100 100 50
32
- Quy trình định lượng insulin được tóm tắt trong hình 2.3.
Hình 2.3. Tóm tắt quy trình định lượng insulin
2.2.3.3. Xác định hoạt độ enzym G6Pase gan
- Nguyên tắc
Glucose-6-phosphat + H2O G 6Pase Glucose + phospho vô cơ (Pi) Phospho vô cơ được xác định theo kỹ thuật của Fiske và Subbarow [51]
Kháng thể cố định trong mỗi giếng của bản nhựa đáy nhọn )
Cho 95 µL dung dịch pha loãng mẫu vào mỗi giếng
5 µL mẫu thử/insulin chuẩn (mỗi mẫu cho vào 1 giếng) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ủ 2 giờ ở 40C
Rửa sạch 5 lần với đệm (Wash buffer stock solution)
Cho 100 µL kháng thể đặc hiệu của insulin đã gắn với enzym vào mỗi giếng Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng
Rửa 7 lần với đệm (Wash buffer stock solution) Cho 100 µL cơ chất vào mỗi giếng
Ủ trong bóng tối, nhiệt độ phòng, trong vòng 40 phút Dừng phản ứng bằng cách thêm 100 µL acid sulfuric 1 N
Đo mật độ quang (A450 và A630)
33
Hoạt độ của G6Pase được tính bằng lượng phospho vô cơ sinh ra trong 1 phút trên 1mg protein gan ở điều kiện nhiệt độ 370C, pH 6,5. Hàm lượng protein trong gan được định lượng bằng phương pháp Lowry [24].
- Tiến hành:
+ Cân 1g gan chuột, cắt thành các miếng nhỏ, sau đó cho vào ống nghiệm đồng thể đã có sẵn 1mL dung dịch đệm lạnh (đệm citrat pH=6,5). Nghiền gan trong điều kiện lạnh (nhiệt độ dưới 40C) đến khi thu được dung dịch đồng thể, sau đó thêm đệm lạnh để được tỉ lệ 1: 5. Dịch nghiền thu được đem ly tâm lạnh ở 00C với tốc độ 3.000 vòng/phút trong 10 phút, lấy dịch trong tiếp tục ly tâm lạnh tốc độ 10.000 vòng/phút trong vòng 30 phút. Phần dịch trong thu được sau khi ly tâm được dùng để xác định hoạt độ enzym.
+ Phản ứng được tiến hành trong ống nghiệm 5mL gồm: 0,5mL đệm citrat (0,1M, pH 6,5); 0,2 mL nước cất; 0,1 mL cơ chất. Dung dịch enzym và dung dịch cơ chất được ủ ở 370C trong 10 phút. Thời gian phản ứng được tính từ lúc thêm 0,2 mL dịch enzym. Tiếp tục ủ trong 10 phút ở 370C. Sau đó thêm 2 mL acid tricloacetic (TCA) 10% để dừng phản ứng, lắc kỹ, để yên 5 phút, ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút, thu được dịch trong làm thí nghiệm xác định phospho vô cơ. Khảo sát sự tương quan giữa mật độ quang và lượng phospho vô cơ và tính kết quả.
+ Tiến hành tương tự với mẫu đối chứng thay cơ chất bằng nước cất, mẫu trắng thay cơ chất và dịch chiết enzym bằng nước cất.
Định lượng protein toàn phần trong dịch nghiền gan
Dựa trên phương pháp Lowry [24].
34
Phức chất đồng - protein khử hỗn hợp phosphomolipden - phosphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất mầu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 660nm.
Cường độ mầu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein. Dựa vào mức độ hấp thụ quang của protein chuẩn, có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.
2.2.3.4. Đánh giá khả năng ức chế protein tyrosin phosphatase 1B in vitro của HDCL HDCL
- Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng loại nhóm phosphat ở phân tử tyrosin đã được phosphoryl hóa (pTyr 1158) trong tiểu đơn vị beta của insulin receptor